骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种高度磷酸化的酸性糖蛋白，最早发现于骨细胞中，作为细胞外骨基质矿化的一种连接蛋白和关键因子而得名[1]。由于其在炎症环境下具有许多细胞调节特性，又被称为早期T细胞活化因子-1(earlyT-cellactivationfactor-1,Eta-1)或分泌性磷蛋白1(secretedphosphoprotein-1,SSP1)[2]。OPN广泛分布于大多数组织和体液中，如骨骼、肾脏、尿液、乳汁等，在母乳中含量最高[3]。OPN分为细胞内OPN(iOPN)和分泌型OPN(sOPN),iOPN存在于免疫细胞，sOPN存在于体液中[4]。它们由相同的mRNA产生，但介导的生物学结果不同[5]。通过翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和蛋白水解加工，不同器官或组织的OPN往往呈现出不同的生物学功能[5,6]。不同的OPN亚型对髓样细胞群与淋巴样细胞群的调节不同，sOPN和iOPN分别通过促进淋巴细胞数量增加和抑制髓系细胞的产生，协调两种细胞群的平衡，防止自身免疫疾病发生[7]。OPN存在RGD(Arg-Gly-Asp)序列、SVVYGLR序列、钙离子结合位点等，通过与细胞膜表面的多种整合素、钙离子、CD44等受体结合，启动和调节骨矿化、骨重塑、细胞粘附和迁移以及免疫调节等过程[6,8]。

母乳是婴儿能量、营养素以及生物活性成分的最佳来源。母乳中骨桥蛋白，是乳清蛋白组分之一，约占母乳中总蛋白含量的5%～10%[9,10]。OPN对婴儿免疫系统成熟、肠道发育、认知发育具有重要意义。本文综述了母乳中骨桥蛋白的存在形式、含量和检测方法以及功能。

1、母乳OPN的存在形式

在母乳和牛乳中，OPN很容易发生接近RGD序列和SVVYGLR序列的蛋白质水解，因此大部分乳液OPN呈裂解后的片段形式存在。母乳OPN由298个氨基酸组成，包含34个磷酸化丝氨酸、2个磷酸化苏氨酸和5个O-糖基化苏氨酸[6]。牛乳(262个氨基酸)和母乳OPN序列比较，氨基酸序列的相似性约是61%,缺乏与母乳OPN序列对应的188～209氨基酸。在母乳OPN序列的36个磷酸化氨基酸中，29个磷酸化氨基酸位于乳腺酪蛋白激酶(caseinkinase,MGCK)的靶序列中，也称为高尔基激酶[S/T-X-E/S(P)/D];6个磷酸化氨基酸位于酪蛋白激酶II(CKII)的靶序列中。磷酸化氨基酸被排列成3～5个磷酸化簇，含有糖基和RGD(Arg-Gly-Asp)整合素结合序列的区域没有磷酸化氨基酸。母乳OPN磷酸化程度显著高于矿化组织如骨OPN,且略高于牛乳OPN(含28个磷酸基团)。母乳OPN富含苏氨酸的区域(残基118～139)均匀分布6个苏氨酸(Thr118、Thr122、Thr127、Thr131、Thr136和Thr139),其中除Thr139外的苏氨酸都是O-糖基化的[11],牛乳OPN含有3个O-糖基化苏氨酸(Thr115、Thr124和Thr129)。

OPN由单个拷贝基因编码，在转录过程中人类OPN可以进行选择性剪接，产生2个剪接变体，每个剪接变体缺少一个外显子，这3种亚型分别是全长异构体(OPNa)、缺乏第5外显子的异构体(OPNb)和缺少第4外显子的异构体(OPNc),在母乳和牛乳中只检测到全长异构体OPNa[12]。

牛乳和母乳OPN的氨基酸序列和磷酸化、糖基化模式相似，并且两者O-糖基化苏氨酸均位于接近RGD序列的未磷酸化区域，因此表现出相似的体外生物活性[11]。例如，O-糖基化位点在细胞粘附活性中起作用，高浓度磷酸化和酸性氨基酸的区域构成与矿物质(如钙盐)的潜在结合位点。研究显示母乳OPN浓度约为48～266mg/L,远高于牛乳(约18mg/L)和婴儿配方奶粉(约9mg/L)[13],建议在婴儿配方奶粉中添加牛乳OPN来缩小其与母乳的浓度差距[14,15]。

2、母乳OPN的含量和检测方法

OPN广泛存在于人体多种组织和体液中，例如：血浆(约35μg/L)、尿液(约4μg/L)[3],其在母乳中的浓度最高(约48～266mg/L)。

2004年NAGATOMO等[9]在日本福冈对20名健康母亲开展队列研究，酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA,Immuno-BiologicalLaboratories)检测结果显示母乳OPN浓度(中位数)随着婴儿月龄增大而变化，产后3～7天OPN含量最高达1493.4mg/L,随后逐渐降低，产后1月为896.3mg/L,产后4～7月为550.8mg/L,至产后11～14月为412.7mg/L。成熟乳(产后1个月)OPN水平远高于同期乳母血浆OPN水平(339.0ng/mL)(P<0.001),并且母乳OPN含量与母亲血浆OPN含量呈正相关(r=0.627,P=0.047)。

2009年SCHACK等[13]对丹麦29名22～37岁母亲产后6～58天的母乳样品进行ELISA(ThermoFisherScientific)检测，得到母乳OPN浓度平均值为(138±79)mg/L。同时，测得3月龄婴儿及脐带血浆中OPN水平比成年人高7～10倍，高水平的母乳OPN和婴儿血浆OPN提示OPN可能对婴儿早期生长发育具有重要意义。

2015年，DALLAS等[16]收集到来自美国母亲分娩后2～58天内的母乳数据，包括8名足月分娩母亲的32个样本，以及14名早产母亲的28个样本。通过质谱分析峰值离子计数测量得到，早产乳和足月乳之间OPN水平差异没有统计学意义，但未报告母乳样品中OPN绝对水平。

2018年BRUUN等[3]进行的多中心研究显示，校正婴儿月龄和产妇年龄后，不同国家的母乳样品OPN含量(中位数)及其在总蛋白质中的占比差异有统计学意义(P<0.01)(ELISA法检测，R&DSystems)。相较于丹麦(318人，产后3月OPN=99.7mg/L),中国母乳中OPN水平(76人，产后30天266.2mg/L)与韩国(117人，产后5周OPN=216.2mg/L)、日本(118人，产后8周OPN=185.0mg/L)更为接近。并且随着婴儿月龄的增加，哺乳期母乳OPN含量逐渐降低。

2019年JIANG等[15]对美国加州12名健康足月分娩母亲的随机临床试验结果也显示，ELISA法(R&DSystems)检测母乳OPN在初乳(产后1～7天)中含量很高(178±17.9)mg/L,到第9天(过渡乳8～14天)逐渐降低(134.8±18.5)mg/L,成熟乳OPN含量显著下降，分别为产后1月(65.8±13.7)mg/L、产后4月(48.8±12.0)mg/L、产后6月(55.9±13.8)mg/L、产后12月(48.3±10.2)mg/L。

目前用于测量母乳OPN含量的方法多为ELISA,不同商业公司ELISA测量结果不尽相同。R&DSystemsELISA可用来测量来自脐带、3月龄婴儿、妊娠和非妊娠成人血浆样品中的OPN浓度；In-househumanOPNELISA是基于对母乳蛋白的多克隆抗体，并以纯化的母乳OPN为标准，新研制的专用于母乳OPN测定的ELISA;IBLELISA尚未被验证可用于母乳OPN的测量。SCHACK等[13]采用上述3种ELISA测定同一批母乳样本(n=14)OPN含量，R&DSystemsELISA测定母乳OPN为(144±83)mg/L,与In-houseELISA测定值(122±70)mg/L差异无统计学意义(P=0.45);而IBLELISA测得母乳OPN浓度为(1175±1137)mg/L,显著高于In-houseELISA测定值(P<0.01)。3组测定值具有良好的相关性(r2>0.8)。前文NAGATOMO等[9]采用IBLELISA测得的母乳OPN含量可能被高估达10倍。

3、母乳OPN在婴幼儿人群中的功能及作用机制

完整的OPN、部分消化的OPN和OPN肽可在肠细胞表面与多种整合素和CD44受体结合，或被吸收进入血液循环到达其靶细胞触发信号通路发挥多种功能。母乳OPN有促进婴幼儿免疫系统建立、肠道发育以及认知发育等功能。

3.1免疫功能

NAGATOMO等[9]通过cDNA基因芯片分析发现，在母乳240个细胞因子相关基因中，OPN基因的表达位居前列。同时免疫组化染色显示，OPN的主要来源是乳腺上皮细胞和乳汁巨噬细胞/单核细胞。这些结果表明，OPN在母乳中大量分泌，并可能在母乳喂养婴儿的免疫发育中发挥潜在作用。

T细胞、B细胞是构成机体免疫系统的主要细胞群。T细胞亚群是细胞免疫的主要免疫应答形式，通过直接杀伤靶细胞、辅助或抑制B细胞产生抗体、产生细胞因子发挥作用。B细胞主要通过呈递抗原和产生抗体发挥体液免疫作用，大多数抗原物质在刺激B细胞形成抗体过程中依赖辅助性T细胞的协助。OPN被认为是诱导辅助型T1(Th1)细胞免疫的关键分子，通过诱导Th1分泌细胞因子白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)促进Th1反应发挥免疫功能[5]。产生Th1反应对于清除细胞内病原体至关重要，OPN敲除小鼠Th1反应有缺陷，相比于野生型小鼠更容易受到单纯疱疹病毒、单核细胞增生李斯特菌和轮状病毒感染[10]。此外，许多研究表明母乳喂养具有预防轮状病毒感染的效果，其中母乳OPN可能是原因之一[10,17]。OPN可以通过RGD(Arg-Gly-Asp)整合素结合序列与多种不同的整合素结合，可竞争性抑制腺病毒RGD序列在靶细胞av整合素附着[18]。

LÖNNERDAL等[19]开展的随机对照试验观察了喂哺含有不同水平牛乳OPN(0、65和130mg/L)的配方奶粉与母乳喂养相比，对0～6月龄婴儿生长发育、铁营养状况、健康状况和细胞因子表达的影响。结果显示添加不同水平牛乳OPN婴儿配方奶粉喂养与母乳喂养的婴儿生长、铁营养状况相似，且这两组婴儿间发热天数无统计学差异，但均明显少于未添加OPN配方奶粉喂养的婴儿。添加OPN配方奶粉喂养婴儿血清中的肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα,TNF-α)浓度与母乳喂养婴儿相似，均明显低于未添加OPN配方奶粉喂养婴儿，这可能是因为OPN通过下调TNF-α水平从而减少炎症信号。此外，母乳及OPN配方奶粉喂养婴儿体内发现较高浓度的IL-12和IL-15,这两种细胞因子由天然免疫细胞产生，是宿主防御细菌和病毒感染的关键介质。基于MetaCore功能分析[20],母乳喂养或添加65mg/LOPN配方奶粉喂养婴儿通过上调细胞增殖及细胞粘附途径，促进免疫细胞的产生和成熟。而母乳喂养和添加130mg/LOPN配方奶粉喂养婴儿外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)表达更多与免疫球蛋白合成及受体相关的基因，其中包括与儿童过敏风险相关基因。因此添加OPN婴儿配方奶粉改变了婴儿PBMC基因的表达，使其接近母乳喂养的婴儿，改善婴儿免疫发育。

3.2肠道发育

母乳中OPN能够抵抗新生儿胃液的消化[15],并到达肠道免疫细胞，诱导其Th1中细胞因子IL-12表达，从而发挥肠道免疫作用[13]。

添加OPN配方奶粉与对照配方奶粉相比，早产仔猪模型的坏死性小肠结肠炎严重程度较低，饲喂富含OPN配方奶粉具有减少腹泻和刺激肠上皮细胞增殖的作用[21]。用添加125mg/LOPN配方奶粉喂养新生恒河猴3个月，其与母乳喂养组恒河猴空肠转录组基因表达更接近，仅有217个基因差异显著，而母乳喂养组和对照配方奶粉组之间有1017个基因差异表达；此外，OPN通过与整合素受体结合，调节肠道细胞增殖、迁移和趋化[22]。利用母乳OPN、重组母乳OPN和牛乳OPN处理人肠上皮细胞(humanintestinalepithelialcell,HIEC),3种OPN均显著刺激HIEC增殖，基因芯片分析结果显示，与增殖和免疫功能紧密相关的基因如有丝分裂原激活的蛋白激酶13(mitogen-activatedproteinkinase13,MAPK13)和细胞周期蛋白E1(cyclinE1,CCNE1)基因等被母乳OPN显著修饰，其中部分基因受重组母乳OPN或牛乳OPN的影响[23]。

此外OPN还可与乳铁蛋白形成强大的静电复合物[24],每个OPN分子能够结合3分子乳铁蛋白从而有助于保护乳铁蛋白免受蛋白水解，保持其在肠道中的生物活性，并帮助其运输到肠黏膜的特定部位。同时，两者形成的复合物抵抗消化能力更强，能更有效地被HIEC细胞摄取、结合从而促进肠道细胞的增殖和分化[25]。

3.3认知发育

髓鞘形成是新生儿早期中枢神经系统发育必不可少的过程。母乳OPN被肠上皮细胞部分吸收，进入循环系统，输送至大脑，提高大脑内OPN水平，从而促进中枢神经髓鞘形成。OPN在大脑中大量表达，并被认为在大脑发育中起作用[4]。母乳中存在高浓度OPN,小鼠乳腺也可表达并分泌OPN。JIANG等[26]建立了OPN小鼠模型，用野生型母鼠(对照)或OPN敲除母鼠(OPN敲除组)喂养野生型幼鼠，两组母鼠产奶量相当，野生型母鼠分泌的乳汁含高浓度OPN,而OPN敲除母鼠的乳汁则不含OPN。通过管饲法饲喂125I标记的母乳OPN,检测到幼鼠大脑中的放射性处于稳定水平，约占进食总OPN的1.7%,并在3h内维持稳定读数，显示饮食中的OPN可以被吸收并转移到大脑。从出生第1天(D1)到D20每隔一天收集一次幼鼠脑样本，两组OPNmRNA表达相似，母乳OPN不会改变幼鼠大脑中OPNmRNA水平，但显著提高了D6和D8对照组幼鼠大脑OPN蛋白水平。OPN敲除组幼鼠记忆力和学习能力较野生型幼鼠弱。对照组幼鼠大脑髓鞘相关蛋白包括脑脊液髓鞘碱性蛋白(myelinbasicprotein,MBP)、髓磷脂相关糖蛋白(myelinassociatedglycoprotein,MAG)的表达增加，NG-2胶质细胞增殖和分化为少突胶质细胞并伴随着细胞外信号调节激酶1/2(extracellular-signalregulatedkinase,ERK-1/2)和磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositide3-kinases,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号转导的增加。综上所述，母乳OPN通过促进髓鞘形成在婴儿的大脑发育和行为发展中发挥重要作用。

4、结语

综上所述，母乳OPN由298个氨基酸组成，呈高度磷酸化和糖基化，整蛋白分泌后常在靠近其整合素结合基序的区域被切割，以蛋白质水解后的片段形式存在。母乳OPN主要由乳腺上皮细胞和乳汁巨噬细胞/单核细胞分泌，不同商业ELISA试剂盒测定OPN含量不尽相同，母乳OPN含量在不同地区也有差异，且随哺乳期的增加而逐渐降低。母乳OPN含量远高于牛乳及以牛乳为原料的普通配方奶粉。高浓度的母乳OPN在婴幼儿免疫系统建立、肠道发育以及认知发育过程中可能发挥重要作用。目前母乳OPN的研究尚处于起步阶段，其含量、功能和机制研究有待深入。

文章来源：周杨,江如蓝,杨振宇.母乳骨桥蛋白研究进展[J].卫生研究,2021,50(04):676-680.