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纳米孔测序检测肺部组织样本在痰涂片阴性肺结核中的诊断价值

2025-06-09 54 上传者：管理员

摘要：目的探讨纳米孔测序检测肺部组织样本对痰涂片阴性肺结核(pulmonary tuberculosis, PTB)的诊断价值。方法收集南宁市第四人民医院接受诊疗的60例疑似PTB患者为研究对象，以临床综合诊断为诊断标准，将最终诊断为PTB的37例患者为病例组，23例未诊断为PTB的患者为对照组。收集患者肺部穿刺组织样本分别进行纳米孔测序、病理学检查及分枝杆菌固体培养。结果纳米孔测序诊断28例阳性样本。相比之下，病理学检查诊断23例，分枝杆菌固体培养为11例。统计指标显示，纳米孔测序的敏感度(75.70%)、特异度(95.70%)、阳性预测值(96.60%)、阴性预测值(71.00%)、Kappa系数(0.669)、检出率(48.33%)及受试者工作特征曲线的曲线下面积值为0.857(95%CI:0.758～0.955)均优于其他方法。此外，韦恩图揭示纳米孔测序与其他方法在诊断上存在重叠及独特检测到的8个阳性病例。结论肺部穿刺组织结合纳米孔测序技术快速精确的特性，将进一步缩短确诊时间，提升诊断精确度，显著优于传统病理学检查及分枝杆菌固体培养。

关键词：
PTB
纳米孔测序
肺结核
肺部组织
诊断价值
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结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,主要感染肺部形成肺结核(Pulmonarytuberculosis,PTB)[1]｡据2023年全球结核病数据统计,2022年有1060万新发结核病患者,发病率为133/10万[2]｡中国是结核病负担最沉重的国家之一,仅次于印度和印度尼西亚[3-4]｡尽管感染后只有少数人会发展为结核病,但早期的检测与治疗能充分发挥预防和治疗结核病的优势[5]｡当前的诊断方法包括抗酸涂片､细菌培养及分子诊断技术等[6]｡然而,以上诊断方法仍存在一定缺陷｡近年来纳米孔测序在结核病的快速诊断中显示出巨大潜力｡肺部穿刺组织能直接从病变组织获取样本,结合纳米孔测序技术能进一步缩短确诊时间,提升诊断精确度｡本研究首次利用肺部组织样本的纳米孔测序和病理学检查及固体培养进行对比,探究其诊断效能｡

1、资料与方法

一､临床资料

本研究回顾性分析南宁市人民医院2022年5月至2023年8月收治的60例疑似PTB且痰液抗酸染色涂片阴性患者,采集肺部组织样本分别进行纳米孔测序､病理学检查及分枝杆菌固体培养｡纳入标准:(1)经临床和影像检查等怀疑PTB｡(2)经历完整的纳米孔测序､病理学检查及分枝杆菌固体培养并具有明确结果｡(3)本人或家属签署知情同意书｡不符合以上标准的被排除在外｡最终由临床医生依据《WS288—2017肺结核诊断标准》结合患者临床特征､影像学检查､实验室指标､病理学检查及治疗反应评估是否为活动性肺结核[7-8]｡诊断PTB包括临床诊断和确诊两类｡临床诊断病例需符合以下条件:①胸部影像学结果支持肺结核诊断｡②结核菌素皮肤试验中度或强阳性,或γ⁃干扰素释放试验阳性,或结核分枝杆菌抗体阳性｡③对于免疫学阴性患者,如果经过至少三个月的抗结核治疗后,肺部病灶面积缩小或消失,可临床诊断为肺结核｡确诊病例需至少满足以下一项或多项标准:痰､肺泡灌洗液或肺组织等标本涂片找抗酸杆菌阳性､分枝杆菌培养阳性､分子生物学检查阳性,或肺组织病理学检查阳性｡排除痰液抗酸染色涂片及分子生物学阳性者｡最后共纳入60例患者,其中37例诊断为肺结核,定义为病例组,23例未感染结核,定义为对照组｡本研究为回顾性研究,在整个研究过程中未涉及任何能够识别患者身份特征的信息,且通过本院医学伦理审查([2023]24)｡

二､研究方法

1.样本采集

在病变部位进行样本采集时,使用CT作为穿刺引导工具,确保精准定位肺部病变区域｡采集过程包括全面评估患者､选择适当设备､彻底消毒及必要的局部麻醉,利用CT引导精确定位穿刺针,获取组织样本,处理并送往实验室分析｡同时,采样后需对患者进行观察,以及时处理可能的并发症｡

2.病理学检查从疑似

PTB患者中通过经皮肺穿刺取得肺部组织样本,并立即置于10%中性缓冲福尔马林固定液中｡随后,组织样本经过脱水､清洁､石蜡浸润及切片处理,通常切片厚度为4~6微米｡然后,采用萋尼氏抗酸染色法对切片进行染色以便在显微镜下特异性地观察结核分枝杆菌,寻找典型的干酪样坏死､结核性肉芽肿等｡必要时,辅以免疫组化或分子病理学检测以提高诊断准确性｡所有观察到的病理变化和检测结果被详细记录,并且按照《中国结核病病理学诊断专家共识》确定是否存在PTB的病理学证据[9]｡病理学检查阳性为病理组织具有肉芽肿､干酪样坏死等典型结核病理特征或者抗酸杆菌阳性｡整个流程严格遵循生物安全和实验室操作规程,确保实验人员安全和结果的准确性｡

3.纳米孔测序

在实验的前期阶段,准备蛋白酶K､溶菌酶和质粒,并将待测样本加入EP管中｡接着,向其中加入等体积的DTT液,10μL的蛋白酶K,5μL的溶菌酶,以及0.05mm的氧化锆研磨珠,并使用研磨机进行充分研磨｡随后,开始核酸提取过程,首先将待测样本与试剂混合孵化,然后加入800μL新鲜配制的80%乙醇,盖上管子并涡旋振荡30秒后离心,将EP管放回板架上｡之后添加磁珠,并进行10至15秒的涡旋振荡,静置片刻后弃去上清液｡接着,吸取600μL1×WB液并加入乙醇后同样弃去上清液｡处理完EP管后,激活磁珠并进行孵化｡利用Qubit4.0DNA浓度测量仪器,取199μL的1×dsDNAHSbuffer加入0.6mL的管中,再加入1μL已提取的核酸样本｡经过10至15秒的涡旋振荡和瞬间离心,检查是否有气泡产生,然后在避光条件下静置2分钟｡最后,将其放入检测仪器中进行核酸质量检测,并确认其符合标准｡接下来,配制PCR反应体系,添加DNA并审核各组分,然后将反应管置于PCR仪中启动运行｡完成反应后,对产物进行纯化处理,并最终吸取DNA文库｡针对多重PCR的产物进行barcode标记及PCR扩增,随后保存这些产物｡对PCR产物进行纯化和质量检验,将带有不同标签的产物混合后,依照纳米孔连接建库试剂盒的指南进行后续操作｡制备好的文库被用于GridION测序｡收集到的数据经过质量过滤和比对分析后,得出了病原微生物种类及耐药基因的分析结果｡

4.固体培养

将4克NaOH溶解于100mL蒸馏水,制备成4%溶液高压蒸汽灭菌｡向5mL样本中加入等体积的4%NaOH溶液,涡旋混合20秒后静置15分钟,再加入pH7.2的磷酸盐缓冲溶液离心沉淀固体｡整个处理流程时间控制在20分钟内｡使用珠海贝索技术有限公司提供的改良洛温斯坦培养基,将0.1mL经过预处理的样品无菌地均匀涂布到培养基上｡接种后,第3天和第7天进行观察,之后每周检查一次｡若发现阳性结果,立即确认并报告,快速生长型细菌在7天内出现,缓慢生长型细菌在7天后出现｡阴性结果需持续观察至第8周后才报告｡

三､统计学方法

本项研究运用SPSS24.0软件进行统计分析,本研究生成了2×2列联表｡评估诊断效能的指标包括:灵敏度､特异度､阳性预测值(Positivepredic⁃tivevalue,PPV)､阴性预测值(Negativepredictivevalue,NPV)､Kappa系数以及受试者工作特征曲线(Receiveroperatingcharacteristiccurve,ROC)的曲线下面积(Areaunderthecurve,AUC)｡本研究采用McNemar卡方检验,进行纳米孔测序､病理学检查及分枝杆菌固体培养诊断效能的比较｡当P<0.05时,认为差异具有统计学意义｡

2、结果

一､临床资料特征

本研究共纳入60例疑似PTB患者,其中37例为病例组,其中32例为确诊病例,5例为临床诊断病例,23例为对照组｡整体样本的平均年龄为(52.28±17.5)岁;病例组的平均年龄为(50.16±3.23)岁,对照组的平均年龄为(55.7±13.1)岁｡性别分布方面,男性共计39人,其中病例组27人(72.97%),对照组12人(52.17%);女性共计21人,病例组10人(27.03%),对照组11人(47.83%)｡在其他疾病的存在情况中,共有2个HIV病例[病例组1人(2.70%),对照组1人(4.35%)],9个糖尿病病例[病例组5人(13.51%),对照组4人(17.39%)]｡此外,有2个病例(8.70%)合并非结核分枝杆菌(NTM)感染,均出现在对照组(表1)｡

二､三种检测方式的诊断准确性

对纳米孔测序与病理学检查和分枝杆菌固体培养这三种诊断方法的诊断效能进行了比较｡结果显示,纳米孔测序共检测出阳性29例,其中诊断出阳性病例28例｡其次是病理学检查诊断阳性23例,分枝杆菌固体培养诊断11例｡纳米孔测序的敏感度(75.70%)､特异度(95.70%)､PPV(96.60%)､NPV(71.00%)､Kappa系数(0.669)和检出率(48.33%)显著优于其他两种检测方法(见表2)｡纳米孔测序的AUC值为0.857(95%CI:0.758~0.955),显著高于病理学检查[0.789(0.674~0.904)]及分枝杆菌固体培养[0.583(0.437~0.729)]｡本研究进一步进行了纳米孔测序与其他两种检测方法的比较,图1显示了三种检测手段的诊断重叠区域及差异区域｡

表1患者临床基线特征[n(%)]

表2不同检测方法的诊断准确性对比

图1三种检测手段的阳性病例维恩图

3、讨论

肺结核早期起病隐匿,准确的早期诊断对患者个人的治疗及公共卫生的传染病控制具有重要意义｡临床上诊断结核病常用的样本类型包括痰液､肺泡灌洗液､脑脊液､胸腹水或病变部位活检组织等｡其中肺部组织样本可以直接从病变部位获取,能够准确反映肺部的病理状态,包括结核病特有的病理改变,如肉芽肿形成､干酪样坏死和炎症反应,从而使诊断更加直接准确｡然而现有的检测手段或多或少都存在一定局限性,未能很好结合肺部组织样本的优势实现快速､精确的临床诊断｡如病理活检技术对于穿刺组织样本的固定､切片､染色等步骤都需要高度的专业技术,任何一步的疏忽都可能影响到最终的病理分析结果｡此外病理诊断本身也存在一定的主观性,不同病理医生对组织学图片的解读可能存在差异,特别是在一些边界性病变或非典型病理表现时,不同专家的诊断意见可能不完全一致｡随着第三代纳米孔测序技术在呼吸道感染的诊断领域得到广泛应用并迅速进步[10-11],为利用肺部穿刺组织样本的快速､精确的临床检测带来了新的机遇｡第三代纳米孔测序技术最初被应用于基因组的测序和组装,得益于其提供的超长读段,该技术在处理复杂基因组､揭示基因组结构变异以及解决重复序列区域的挑战中表现出了卓越的能力[12]｡凭借能够快速提供精确诊断信息的能力,纳米孔测序为控制传染病的传播和制定有效治疗策略提供了关键支持[13-18]｡在面对如结核分枝杆菌这样传播性强且迫切需要快速诊断的病原体时,第三代纳米孔测序技术的价值尤为凸显｡通过这种高效､灵敏的测序方法,临床医生能够在关键时刻做出更加明智的公共卫生决策,从而有效地遏制疾病的蔓延｡

本研究探讨了利用纳米孔测序技术对痰涂片阴性肺结核病例进行诊断的有效性,并与传统的病理学检查及结核分枝杆菌固体培养方法进行了对比｡研究结果揭示,纳米孔测序技术在诊断肺结核方面展现出显著的优越性,尤其在诊断敏感度及特异性等关键指标上均优于传统方法｡在本次研究中,纳米孔测序技术共识别出29例阳性病例,其中28例被准确诊断,显示出较高的诊断精度｡与之相比,病理学检查和结核分枝杆菌固体培养分别只能准确诊断出23例和11例阳性病例｡此外,纳米孔测序的灵敏度为75.70%,特异度为95.70%,阳性预测值为96.60%,阴性预测值为71.00%,以及卡帕系数为0.669,这些指标均显著高于其他两种传统诊断方法｡进一步分析纳米孔测序与其他诊断方法的对比数据时,通过ROC曲线的AUC值比较可见,纳米孔测序的诊断效能(AUC=0.857,95%CI:0.758~0.955)显著优于病理活检(AUC=0.789,95%CI:0.674~0.904)和结核分枝杆菌固体培养(AUC=0.583,95%CI:0.437~0.729)｡通过对比不同检测手段的覆盖区间和交集,纳米孔测序能够成功识别8个阳性样本,而这些样本在其他两种检测方法下均呈阴性｡此外,纳米孔测序与病理学检查在阳性结果上的重合度最高(共19例)｡这一发现表明,纳米孔测序有潜力成为病理学检查的有效替代方法｡

然而,本研究也存在一些局限性,包括相对较小的样本量可能影响结果的普遍性和可靠性;受试者先前使用过的抗生素可能导致假阴性结果;以及所有参与者来自同一地区可能带来的地域性偏见｡未来研究需要在更大规模､多中心和标准化的条件下进行,以克服这些局限并进一步验证纳米孔测序在肺结核诊断中的应用潜力｡

采用肺部穿刺组织结合纳米孔测序技术在痰涂片阴性结核病的快速诊断,为发展中国家乃至全球结核病控制提供了新的策略和视角｡它不仅能提高诊断的准确性和效率,还有助于优化治疗方案,降低治疗成本,最终实现更有效的结核病控制和预防｡

参考文献:

[7]唐小莉,戴广川,高卫卫,等.宏基因组二代测序在肺结核诊断中的应用[J].临床肺科杂志,2023,28(10):1541-1545.

[8]马永贞,程东帅,陆月明.BALFtNGS在老年人肺结核诊断中的价值[J].中国基层医药,2024,31(7):961-964.

[9]中华医学会结核病学分会,结核病病理学诊断专家共识编写组.中国结核病病理学诊断专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2017,40(6):419-425.

基金资助:广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题(Z-A20231211);北京市卫健委医务社工多元培育计划(YG239002); 北京市科委应用场景项目(20230470104);

文章来源:朱庆东,宋畅,赵春艳,等.纳米孔测序检测肺部组织样本在痰涂片阴性肺结核中的诊断价值[J].临床肺科杂志,2025,30(06):857-861.