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活动性肺结肺结核核患者LAG-3的表达及其对CD4+T细胞的影响

2024-03-15 125 上传者：管理员

摘要：目的探讨淋巴细胞活化基因3(LAG-3)在活动性肺结核患者CD4+T细胞中的表达情况及其对CD4+T细胞功能的影响。方法纳入2020年5月-2021年5月就诊于苏州大学附属传染病医院的25例初治活动性肺结核患者作为病例组，20名健康体检者作为对照组，流式细胞术检测外周血和支气管肺泡灌洗液中LAG-3+CD4+T细胞的比例；体外用结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌靶抗原6 000 Mr与培养滤过蛋白10 000 Mr(ESAT-6/CFP10)刺激结核患者的外周血单个核细胞(PBMC)，分为ESAT-6/CFP组和不加ESAT-6/CFP蛋白的Control组，探究LAG-3在结核特异性CD4+T细胞上的表达；用可溶性LAG-3(sLAG-3)蛋白抑制LAG-3分子信号通路，作为sLAG-3组，探究LAG-3对CD4+T细胞功能的影响。结果病例组患者PBMC和支气管肺泡灌洗液(BALF)中LAG-3+CD4+T细胞比例升高，治疗后下降，差异均有统计学意义(t=2.291、3.045,P均<0.05)。经过ESAT-6/CFP10刺激后的ESAT-6/CFP10组CD4+T细胞上LAG-3的表达上调，而干扰素-γ(IFN-γ)的表达下降，与Control组相比差异均有统计学意义(t=6.174、3.476,P均<0.05)。抑制LAG-3分子信号后，与ESAT-6/CFP10组相比，sLAG-3组CD4+T细胞上IFN-γ和Granzyme B的表达升高，差异均有统计学意义(t=3.882、3.205,P=0.178、0.033)。结论活动性肺结核患者体内CD4+T细胞上LAG-3的表达升高，抗结核治疗后下降，LAG-3可能可以通过抑制CD4+T细胞IFN-γ的分泌，损害CD4+T细胞抗结核分枝杆菌的能力。

关键词：
CD4+T细胞
外周血单个核细胞
支气管肺泡灌洗液
淋巴细胞活化基因3
肺结核
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结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染引起的一种严重的慢性传染性疾病。CD4+T细胞是抗MTB感染的主要免疫细胞，其有效的抗MTB作用是机体清除MTB的重要保障[1]。T细胞活化需要2种细胞信号参与，即主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）提供的第一信号及正性和负性共刺激分子提供的第二信号。尤其是第二信号对于免疫细胞的完全激活及生物学效应有着重要调节作用[2,3]。淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3,LAG-3）是免疫细胞表面的一种负性共刺激分子，纤维蛋白原样蛋白1(fibrinogen-like protein 1,FGL-1）是其主要配体，当LAG-3和相应的配体结合后，传递抑制性信号，可抑制免疫细胞的增殖、活化、细胞因子的分泌等多种生物学效应[4]。有研究表明，长期的慢性感染和肿瘤抗原的刺激，CD4+T细胞表面的LAG-3会上调[5]。

目前，有关LAG-3在活动性肺结核（active pulmonary tuberculosis,ATB）中的研究较少，鉴于LAG-3在免疫调节中的重要作用及CD4+T细胞重要的抗结核功能，本课题探索了抗结核治疗前后，ATB患者体内CD4+T细胞上LAG-3的变化，并用结核分枝杆菌特异性抗原早期分泌靶抗原6 000 Mr与培养滤过蛋白10 000 Mr(early secreted antigenic target 6 000 Mr and culture filtrate protein 10 000 Mr,ESAT-6/CFP10）融合蛋白体外刺激ATB患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC），探究结核特异性CD4+T细胞上LAG-3的表达情况，用可溶性LAG-3(solubility LAG-3,s LAG-3）抑制LAG-3信号通路，观察是否能够恢复CD4+T细胞的部分功能。

1、资料与方法

1.1 一般资料

2020年5月-2021年5月就诊于苏州大学附属传染病医院肺科的25例初治ATB患者作为病例组。收集病例组患者抗结核治疗前后的PBMC和支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）。病例组中男12例，女13例。年龄20～60岁，平均33.5岁。根据病原学和影像学联合诊断，患者均符合结核病的诊断标准，排除合并高血压、糖尿病、肝炎、艾滋病等疾病的患者。同时收集体检中心作为对照组的20名健康体检者PBMC，对照组中男11名，女9名，年龄20～60岁，平均34.9岁，结核菌素（purified protein derivative,PPD）试验和干扰素释放（interferon gamma release assay,IGRA）试验为阴性，胸部X片正常，近期未接触结核病患者。所有参与者均已签署知情同意书，本研究在苏州大学附属传染病医院伦理委员会的监督指导下进行[（2020）院伦理审字号（018）]。

1.2 试剂与仪器

人淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司；抗人CD3-PE-CF594抗体、LAG-3-Bv421抗体、CD4-APC抗体、抗人CD3/CD28激动型抗体、细胞固定液、细胞裂解液（10x）购自e Bioscience公司；Granzyme B-PE抗体、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)-PE抗体，IFN-γ刺激液购自Biolegend公司；抗人CD3-FITC抗体购自BD Pharmingen公司；重组LAG-3蛋白购自R&D公司；ESAT-6/CFP10蛋白购自北京万泰生物药业股份有限公司；FACS Calibur流式细胞仪购自BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 PBMC的提取

2 m L全血中加入2 m L PBS溶液稀释，轻轻用吸管混匀，然后将稀释的全血缓慢沿着管壁加入到15 m L离心管Ficoll液上层（避免全血冲破Ficoll液表层，2种液体混合在一起），716×g离心20 min，取出白膜层洗涤2次后倒掉上清，沉淀即最终需要的PBMC。

1.3.2 肺泡灌洗液细胞的分离及冻存

将接收的肺泡灌洗液716×g离心10 min，弃上清，洗涤2次，沉淀即最终需要的灌洗液细胞，-80℃冻存。

1.3.3 FACS检测免疫细胞表面分子

将提取的PBMC置于干净的流式管中，2μL流式抗体用100μL PBS抗体悬浮，检测管中依次加入相应组合的流式抗体，先进行表面染色，后行细胞固定、破膜，进行胞内细胞因子荧光素标记染色。T细胞选用CD3-PE-CF594和CD4-APC单克隆抗体及鼠抗人LAG-3-BV421抗体，鼠抗人IFN-γ-PE抗体，鼠抗人Granzyme B-PE抗体染色；阴性染色圈门管只用CD3-PE-CF594和CD4-APC进行染色。反应物在4℃条件下避光孵育20 min,PBS终止反应、漂洗，100μL PBS重悬后于BD FACS Calibur流aa式细胞仪上机检测，数据应用Flow Jo10.0软件分析。

1.3.4 FACS分析活化CD4+T细胞表面LAG-3及细胞内IFN-γ的表达

Ficoll密度梯度离心法分离活动性肺结核患者外周血PBMC，用200μL RMPI1640完全培养基悬浮，置于96孔的细胞培养皿（1×105个细胞/孔），加入抗人CD3(100 ng/m L）和CD28(50 ng/m L），加2μL ESAT-6/CFP10融合蛋白作为ESAT-6/CFP10组，另有不加ESAT-6/CFP10蛋白作为Control组，培养24 h后用淋巴细胞刺激液刺激4 h，收集细胞进行表面染色，后行细胞固定、破膜，进行胞内细胞因子荧光素标记染色，阴性染色圈门管只用CD3-FITC和CD4-APC进行染色，FACS上机检测。

1.3.5 抑制LAG-3后FACS分析CD4+T细胞IFN-γ和Granzyme的表达

Ficoll密度梯度离心法分离活动性肺结核患者外周血PBMC，用200μL RMPI1640完全培养基悬浮，用96孔的细胞培养皿（1×105个细胞/孔）培养，加入抗人CD3(100 ng/m L）和CD28(50 ng/m L），加2μL ESAT-6/CFP10融合蛋白和s LAG-3蛋白10μg/m L作为s LAG-3组，另有不加s LAG-3蛋白作为对照，37℃，5%CO2培养24 h后用淋巴细胞刺激液刺激4 h，收集细胞进行表面染色，后行细胞固定、破膜，进行胞内细胞因子荧光素标记染色，阴性染色圈管只用CD3-FITC和CD4-APC进行染色，FACS上机检测。

1.4 统计学分析

采用Graphpad Prism 6.0对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料用表示，两组间采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 LAG-3+CD4+T细胞在ATB患者PBMC中的变化

流式细胞术结果显示，对照组、病例组治疗前和治疗后3组间的CD4+T细胞比例差异无统计学意义（P>0.05），见图1A、B；病例组治疗前LAG-3+CD4+T细胞比例（12.71±0.51）%高于病例组治疗后（10.83±0.52）%，并且两组的LAG-3+CD4+T细胞均高于对照组（1.88±0.21），差异均有统计学意义（P均<0.05），见图1A、C。

病例组治疗前病例组治疗后图1 ATB患者抗结核治疗前后PBMC中LAG-3+CD4+T细胞的表达

2.2 LAG-3+CD4+T细胞在ATB患者BALF中的变化

BALF的流式细胞术结果显示，病例组抗结核治疗前后CD4+T细胞比例[（68.68±3.05）%、（63.99±3.01）%]差异无统计学意义（t=1.076,P>0.05），病例组治疗前LAG-3+CD4+T细胞比例（39.91±5.51）%高于病例组治疗后（19.79±3.95）%，差异有统计学意义（t=3.045,P<0.05），见图2。

2.3 ESAT-6/CFP10蛋白刺激后CD4+T细胞表面LAG-3的变化

用ESAT-6/CFP10蛋白刺激ATB患者的PBMC，发现在刺激24 h后，与Control组相比，ESAT-6/CFP10组CD4+T细胞表面LAG-3分子增加，而IFN-γ的表达下降，差异均有统计学意义（t=6.174、3.476,P均<0.05），见图3。

图2 ATB患者抗结核治疗前后BALF中LAG-3+CD4+T细胞的表达

2.4 抑制LAG-3信号通路后CD4+T细胞上IFN-γ的表达变化

图3 ESAT-6/CFP10刺激ATB患者PBMC后CD4+T细胞上LAG-3和IFN-γ的表达

抑制LAG-3信号通路后，与ESAT-6/CFP10组相比，s LAG-3组CD4+T细胞表面IFN-γ和Granzyme B的表达显著增加，差异均有统计学意义（t=3.882、3.205,P=0.178、0.033），见图4。

3、讨论

结核病是机体的免疫系统和MTB相互抗衡的过程，免疫能力降低是结核病发病的主要原因[6,7]。BRETSCHER等[8]两位学者首先提出了T细胞活化的“共刺激信号”。而如今，越来越多的共刺激分子及其功能被探索。LAG-3是细胞表面的一种负性共刺激分子[5]，其介导的负性调控作用导致肿瘤的免疫逃逸现象，使它成为一个有前景的免疫干预靶点。目前LAG-3在结核患者中的研究极少，在动物模型中，PHILLIPS等[9,10]报道了MTB感染的恒河猴的肺组织高表达LAG-3,LAG-3表达升高与高细菌负荷和低Th1型细胞反应相一致；沉默LAG-3的CD4+T细胞表现出更强的杀伤能力，IFN-γ的表达明显升高。

图4 抑制ATB患者PBMC中LAG-3信号后CD4+T细胞IFN-γ和Granzyme B的表达

本研究首先探究ATB患者体内LAG-3的表达情况，纳入25例初治ATB患者作为病例组，通过流式细胞技术发现ATB患者PBMC和BALF中的CD4+T细胞表面LAG-3的表达升高，抗结核治疗后下降，可能是因为MTB慢性刺激使患者体内CD4+T细胞表面LAG-3的表达上调，抗结核治疗后，患者的免疫功能部分恢复，CD4+T细胞表面LAG-3的表达下降。经过分析发现，BALF中的LAG-3+CD4+T细胞在抗结核治疗后下降更明显，提示MTB对炎症组织部位中的CD4+T细胞影响更为显著。

体外用结核特异性抗原ESAT-6/CFP10蛋白刺激结核患者外周血细胞，发现CD4+T细胞分泌IFN-γ的能力降低，而CD4+T细胞功能的下降和LAG-3是否相关需要进一步被证明，于是通过抑制LAG-3信号通路，观察CD4+T细胞功能的变化。IFN-γ和Granzyme B是目前用来评估细胞功能中常用的2个细胞分子，在培养时加入sLAG-3蛋白，结果显示，CD4+T细胞内的IFN-γ和Granzyme B的表达上升，提示抑制LAG-3信号通路，CD4+T细胞的分泌和效应功能有所增加，表明LAG-3的表达升高可能会损害CD4+T细胞的功能。

本研究也存在一定的局限性，由于结核患者的纳入和收集较为困难，所以病例数较少，后续会继续招募患者，扩大样本量；同时可以收集更多的样本，将活动性肺结核患者联合其他结核（隐形感染者、非结核分枝感染者）进行分析；可以收集抗结核治疗后不同时间段的样本，进一步分析该分子在对结核治疗后不同时间段的表达。

综上所述，本研究说明LAG-3+CD4+T细胞在活动性肺结核患者的体内呈现高比例状态。LAG-3可能通过影响CD4+T细胞的细胞因子分泌来影响疾病的进展，深入研究该分子对免疫细胞的调节作用或将为活动性肺结核的靶向治疗提供有力的理论依据。

参考文献:

[3]王旭,张宁宁,沈燕,等. PDL1融合蛋白抑制CD8+T细胞过度活化对小鼠脑型疟的保护性作用[J].热带医学杂志,2022,22(3):322-326,338,447.

[7]范彦博,王安帮,夏青,等.结核T细胞斑点试验在肺癌合并肺结核中的应用及影响因素[J].分子诊断与治疗杂志,2022,14(6):957-960,965.

基金资助:国家自然科学基金(81900577);江苏省卫生健康委科研项目(M2021066);苏州市科技计划(SZS2020311,SLJ2021017,SLT2021012,SYS2020190);

文章来源:陈洁,胥萍.活动性肺结核患者LAG-3的表达及其对CD4~+T细胞的影响[J].热带医学杂志,2024,24(02):214-218+250.