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支气管肺泡灌洗液宏基因组二代测序对肺结核的诊断价值

2024-04-13 45 上传者：管理员

摘要：比较支气管肺泡灌洗液(BALF)宏基因组二代测序(mNGS)、Xpert、抗酸染色诊断肺结核的效能，探讨BALF mNGS对肺结核的诊断价值。方法 2021年5月—2023年7月河南省人民医院诊治疑似肺结核患者265例，均行支气管镜检查及BALF mNGS、Xpert、抗酸染色检测。以病原学和组织病理学结果为肺结核诊断标准，265例患者中肺结核34例为肺结核组，非肺结核231例为非肺结核组，比较2组年龄、肺部合并症等临床资料及mNGS检出的混合感染病原微生物，计算BALF mNGS、Xpert、抗酸染色对结核分枝杆菌复合群的检出率及诊断肺结核的灵敏度和特异度。观察肺结核组BALF mNGS检出低序列数情况，比较Xpert、抗酸染色阳性与阴性者mNGS序列数。结果肺结核组年龄[47.5(30.0, 70.5)岁]小于非肺结核组[59.0(50.0, 69.0)岁](Z=2.317,P=0.021),肺部合并症、肺外合并症及BALF mNGS检出的混合感染病原微生物与非肺结核组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。34例肺结核患者中BALF mNGS阳性29例，Xpert阳性24例，抗酸染色阳性11例，其中mNGS、Xpert、抗酸染色均阳性8例，mNGS、Xpert均阳性22例，mNGS、抗酸染色均阳性8例。BALF mNGS、Xpert对结核分枝杆菌复合群的检出率(10.9%、9.1%)均高于抗酸染色(4.2%)(χ2=8.654,P=0.003;χ2=6.050,P=0.012),BALF mNGS与Xpert比较差异无统计学意义(χ2=0.900,P=0.343)。BALF mNGS、Xpert诊断肺结核的灵敏度(85.3%、70.6%)均高于抗酸染色(32.4%)(χ2=12.042,P<0.001;χ2=8.471,P=0.002),BALF mNGS与Xpert比较差异无统计学意义(χ2=1.778,P=0.180)。BALF mNGS、Xpert、抗酸染色诊断肺结核的特异度(100.0%、99.6%、99.1%)比较差异无统计学意义(χ2=2.000,P=0.368)。BALF mNGS联合Xpert诊断肺结核的灵敏度(91.2%)高于Xpert(χ2=5.143,P=0.016),与BALF mNGS比较差异无统计学意义(χ2=0.500,P=0.500),特异度(99.6%)与BALF mNGS、Xpert比较差异均无统计学意义(χ2<0.001,P>0.999;χ2<0.001,P>0.999)。肺结核组mNGS低序列数(0～3)4例，其中Xpert阳性2例，抗酸染色均为阴性。Xpert阳性者mNGS序列数[798.0(8.8,83 139.0)]高于Xpert阴性者[9.5(0,205.3)](Z=2.423,P=0.015),抗酸染色阳性者mNGS序列数[66 137.0(0,361 759.8)]与抗酸染色阴性者[22.5(3.3,747.3)]比较差异无统计学意义(Z=1.515,P=0.130)。结论 BALF mNGS诊断肺结核的效能高于抗酸染色，BALF mNGS联合Xpert可提高诊断肺结核的灵敏度。

关键词：
宏基因组二代测序
支气管肺泡
灌洗液
结核分枝杆菌
肺结核
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肺结核是一种由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)感染引起的呼吸系统传染病，2022年全球约750万人被诊断为肺结核，我国结核病发病人数居世界第3位[1]。早期诊断肺结核对消除传染源、控制流行有重要意义。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)通过检测微生物核酸片段信息鉴定微生物，有对病原微生物检出率高、检测全面的优点，已用于各种感染性疾病的诊断。本研究比较支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)mNGS、Xpert、抗酸染色诊断肺结核的效能，探讨BALF mNGS对肺结核的诊断价值，报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

2021年5月—2023年7月河南省人民医院诊治疑似肺结核患者265例，男158例，女107例；年龄59(47.5,69.0)岁。纳入标准：(1)有咳嗽、发热、咯血、盗汗、体质量减轻等结核中毒症状；(2)胸部影像学检查提示有斑片影、结节影或空洞等；(3)行BALF mNGS、Xpert及抗酸染色检测。排除标准：(1)既往诊断为肺结核者；(2)临床资料不完整者。本研究经河南省人民医院伦理委员会批准通过，研究对象均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1临床资料收集

收集患者临床资料，包括性别、年龄、合并症、血生化指标、痰涂片、痰培养、BALF mNGS、Xpert及抗酸染色结果、组织病理检查结果、治疗转归等。

1.2.2 BALF采集与送检

患者均行支气管镜检查，根据支气管镜BALF采集标准操作流程[2],将支气管镜顶端嵌顿在目标支气管段或亚段开口处，经操作孔道快速分次注入室温生理盐水，20～50 mL/次，总量60～120 mL,注入生理盐水后立即用合适负压吸引采集BALF,总回收率≥30%。采用无菌容器收集BALF,行BALF mNGS、Xpert及抗酸染色检测，送检量均≥5 mL,室温2 h内送检。

1.2.3 BALF抗酸染色

对BALF标本进行涂片、干燥、制片后行抗酸染色，应用油镜观察抗酸杆菌分布情况，蓝色背景中有紫红色杆状抗酸菌为抗酸染色阳性[3]。

1.2.4 BALF Xpert

将BALF标本处理后行PCR扩增，应用利福平耐药实时荧光定量核酸扩增仪GeneXpert Dx(美国Cepheid公司)进行检测，5个探针中至少有2个探针阳性为Xpert阳性。

1.2.5 BALF mNGS

采用IDseqTMUltra病原捕获宏基因检测技术和多重病原体检测技术进行检测。取600μL BALF,分别应用建库试剂盒(广州微远基因科技有限公司)、二代测序文库试剂盒(南京实践医学检验有限公司)提取DNA,构建DNA文库，应用Nextseq550Dx测序仪(美国Illumina公司)、Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent Technologies公司)测序，去除低复杂度、过短序列，与微生物大数据库比对，进行数据分析。结核分枝杆菌阳性结果判读：由于结核分枝杆菌为胞内菌，核酸提取困难，至少1个序列数即可判断为阳性[4,5]。观察BALF mNGS检出低序列数情况，比较Xpert、抗酸染色阳性与阴性者mNGS序列数。

1.2.6组织病理检查

采用HE染色，组织病理典型表现为上皮细胞样肉芽肿性炎，可见典型结核结节。不具备典型表现者根据抗酸染色、PCR法、原位杂交和基因测序等方法明确诊断。以病原学和组织病理学结果为肺结核诊断标准[3],265例患者中肺结核34例为肺结核组，非肺结核231例为非肺结核组，比较2组年龄、性别、肺部合并症、肺外合并症、mNGS检出的混合感染病原微生物。

1.3统计学处理

应用SPSS 26.0软件进行统计分析，非正态分布计量资料以中位数(四分位数)[M(Q1, Q3)]表示，2组比较采用Mann-Whitney U检验；计数资料比较采用χ2检验、校正χ2检验或Fisher确切概率法；以病原学和组织病理学结果为金标准，计算BALF mNGS、Xpert、抗酸染色诊断肺结核的灵敏度、特异度；检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 2组年龄、肺部合并症等临床资料比较

肺结核组年龄小于非肺结核组(P<0.05),性别比例、肺部合并症、肺外合并症与非肺结核组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组年龄、肺部合并症等临床资料比较

2.2 2组BALF mNGS检出的混合感染病原微生物比较

2组BALF mNGS检出的混合感染病原微生物比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组BALF mNGS检出的混合感染病原微生物比较

2.3 3种方法对MTC的检出率比较

34例肺结核患者中BALF mNGS阳性29例，Xpert阳性24例，抗酸染色阳性11例，其中mNGS、Xpert、抗酸染色均阳性8例，mNGS、Xpert均阳性22例，mNGS、抗酸染色均阳性8例。BALF mNGS、Xpert对MTC的检出率(10.9%、9.1%)均高于抗酸染色(4.2%)(χ2=8.654,P=0.003;χ2=6.050,P=0.012),BALF mNGS与Xpert比较差异无统计学意义(χ2=0.900,P=0.343)。

2.4 3种方法及mNGS联合Xpert诊断肺结核的效能

以病原学和组织病理学结果为金标准，BALF mNGS、Xpert、抗酸染色及BALF mNGS联合Xpert诊断肺结核的灵敏度分别为85.3%、70.6%、32.4%、91.2%,特异度分别为100.0%、99.6%、99.1%、99.6%。BALF mNGS、Xpert诊断肺结核的灵敏度均高于抗酸染色(χ2=12.042,P<0.001;χ2=8.471,P=0.002),BALF mNGS与Xpert比较差异无统计学意义(χ2=1.778,P=0.180)。BALF mNGS、Xpert、抗酸染色诊断肺结核的特异度比较差异无统计学意义(χ2=2.000,P=0.368)。BALF mNGS联合Xpert诊断肺结核的灵敏度高于Xpert(χ2=5.143,P=0.016),与BALF mNGS比较差异无统计学意义(χ2=0.500,P=0.500),特异度与BALF mNGS、Xpert比较差异均无统计学意义(χ2<0.001,P>0.999;χ2<0.001,P>0.999)。见表3-6。

表3 mNGS诊断肺结核的效能例

表4 Xpert诊断肺结核的效能例

表5抗酸染色诊断肺结核的效能例

表6 mNGS联合Xpert诊断肺结核的效能例

2.5 Xpert、抗酸染色阳性与阴性者mNGS序列数比较

肺结核组mNGS低序列数(0～3)4例，其中Xpert阳性2例，抗酸染色均为阴性。Xpert阳性者mNGS序列数[798.0(8.8,83 139.0)]高于Xpert阴性者[9.5(0,205.3)](Z=2.423,P=0.015),抗酸染色阳性者mNGS序列数[66 137.0(0,361 759.8)]与抗酸染色阴性者[22.5(3.3,747.3)]比较差异无统计学意义(Z=1.515,P=0.130)。

3、讨论

肺结核的诊断依赖于从呼吸道标本中分离出MTC,目前临床常用检测方法有传统培养方法、抗酸染色、Xpert和mNGS[5]。传统培养方法是结核病诊断的金标准，但检测时间需2～6周，无法满足临床快速诊断的需求，尤其是急危重症患者。抗酸染色方便、快速，但要求标本含菌浓度较高，阳性率较低，无法区分MTC和非结核分枝杆菌。Xpert可在2 h内同时检测MTC和利福平耐药性，对肺结核早期诊断的灵敏度和特异度较高，但无法检测非结核分枝杆菌及鉴定菌种。mNGS作为新兴的病原学诊断技术已广泛用于细菌、真菌、病毒等多种微生物检测，可24 h内提供检测结果[6]。本研究探讨BALF mNGS对肺结核的诊断价值，可为临床早期诊断肺结核提供依据。

结核病在各个年龄段均可发病，好发于婴幼儿、青壮年、老年人、糖尿病、应用免疫抑制剂等人群[7]。本研究结果显示，265例疑似肺结核患者中最终确诊为肺结核34例，肺结核组年龄小于非肺结核组，可能与青壮年人群人口流动性强、对疾病更重视有关。非肺结核组恶性肿瘤患者较多，可能与该组人群年龄偏大有关。

Liu等[8]研究显示，mNGS、Xpert、抗酸染色检测MTC的灵敏度分别为59.9%、69.0%、24.6%,mNGS在33.2% Xpert和培养阴性样本中检测到MTC,在8.7%样本中检测到新的潜在病原体，表明mNGS可非靶向识别病原体，更好地诊断混合感染。Gao等[9]研究纳入186例疑似肺结核患者，发现BALF mNGS诊断肺结核的灵敏度(78.95%)高于抗酸染色(27.59%),与Xpert(72.73%)相近。Shi等[10]研究显示，BALF mNGS对肺结核诊断的灵敏度(47.92%)高于抗酸染色(29.17%),与Xpert(45.83%)比较差异无统计学意义。BALF mNGS检测MTC的灵敏度为55.0%[11]。除BALF外，Zhou等[12]研究发现，mNGS在多种标本(包括脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液、腹腔积液等)中诊断结核病的总体灵敏度为44%,与Xpert相近(42%),但明显高于传统方法(29%)。本研究结果显示，34例肺结核患者中BALF mNGS阳性29例，Xpert阳性24例，抗酸染色阳性11例，其中mNGS、Xpert、抗酸染色均阳性8例，mNGS、Xpert均阳性22例，mNGS、抗酸染色均阳性8例；BALF mNGS、Xpert对MTC的检出率高于抗酸染色，BALF mNGS与Xpert比较差异无统计学意义，表明mNGS与Xpert对MTC的诊断能力相似，考虑与结核杆菌壁较厚、破壁困难有关，可能更适用于疑难危重、混合感染、稀缺样本。本研究结果显示，BALF mNGS(85.3%)、Xpert(70.6%)诊断肺结核的灵敏度均高于抗酸染色(32.4%),BALF mNGS、Xpert、抗酸染色诊断肺结核的特异度(100.0%、99.6%、99.1%)比较差异无统计学意义；BALF mNGS联合Xpert诊断肺结核的灵敏度(91.2%)高于Xpert,特异度(99.6%)与BALF mNGS、Xpert比较差异均无统计学意义，表明mNGS对肺结核患者有良好的筛选能力，mNGS联合Xpert可进一步提高诊断肺结核的灵敏度。本研究BALF mNGS诊断肺结核的灵敏度明显高于Zhou等[12]研究结果，可能是由于入组标本类型不同，不同类型标本的含菌量存在差异，与无菌体腔液体相比，BALF和痰液倾向于更复杂的微生物组成，mNGS的诊断灵敏度和阳性率也相应增高[5,11,13]。

mNGS检测MTC阳性率受结核病初治或复治、胸部影像学空洞的影响，但与3个月内是否使用抗结核药物无关[8]。本研究结果显示，肺结核组mNGS低序列数(0～3)4例，其中Xpert阳性2例，抗酸染色均为阴性；Xpert阳性者mNGS序列数高于阴性者，表明mNGS序列数可能受BALF标本中含菌量的影响。Liu等[8]报道34例、Gao等[9]报道8例MTC序列数为1的疑似肺结核患者，最终均被其他检测方法或经验性治疗证实为肺结核。由于结核菌破壁困难、核酸提取效率低，BALF较咳出痰受污染的概率低，因此，当BALF mNGS检出低序列数MTC,需结合患者病情，排除采样及检测污染后，给予恰当诊断[14]。

本研究结果提示，BALF mNGS诊断肺结核的效能高于抗酸染色，BALF mNGS联合Xpert可提高诊断肺结核的灵敏度。但本研究样本量小、为单中心研究，尚需扩大样本量、进行多中心研究进一步证实。

利益冲突:所有作者声明无利益冲突。

参考文献:

[1]舒薇,刘宇红.世界卫生组织《2023年全球结核病报告》解读[J].结核与肺部疾病杂志,2024,5(1):15-19.

[2]中华医学会呼吸病学分会.肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识(2017年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2017,40(8):578-583.

[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.肺结核诊断标准(WS 288-2017)[J].新发传染病电子杂志,2018,3(1):59-61.

[4]中华医学会呼吸病学分会.下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识[J].中华结核和呼吸杂志,2023,46(4):322-335.

[7]中华医学会,中华医学会杂志社,中华医学会全科医学分会,等.肺结核基层诊疗指南(2018年)[J].中华全科医师杂志,2019,18(8):709-717.

[14]施毅,李培.下呼吸道感染宏基因组二代测序检测出低序列数病原体的诊断价值与思考[J].中华结核和呼吸杂志,2023,46(4):311-314.

基金资助:河南省科技攻关计划项目(182102310549);

文章来源:况红艳,蒋亚芬,赵志刚,等.支气管肺泡灌洗液宏基因组二代测序对肺结核的诊断价值[J].中华实用诊断与治疗杂志,2024,38(04):402-406.