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浅析在宫颈癌筛查中HPVE6/E7mRNA联合TCT检测的临床应用价值

2020-05-25 325 上传者：管理员

摘要：目的：分析HPVE6/E7mRNA联合液基薄层细胞学检测(TCT)在宫颈癌筛查中的临床应用价值。方法：选取2017年1月至2018年12月在上海中医药大学附属第七人民医院妇科门诊行宫颈癌联合筛查的女性1925例,其中接受HPVDNA分型+TCT检测者纳入对照组(n=1050),接受高危型HPVE6/E7mRNA+TCT检测者纳入观察组(n=875),以组织病理学结果为金标准,比较两组不同Bethesda分类、不同病理分型中HPVDNA及HPVE6/E7mRNA阳性率、阴道镜转诊率和患者满意度,分析HPVDNA及HPVE6/E7mRNA分别联合TCT的筛查价值。结果：观察组HPVE6/E7mRNA初筛阳性率为31.09%(272/875),低于对照组HPVDNA初筛阳性率39.14%(411/1050),χ2=13.535,P<0.01;Bethesda分类中,未见上皮内病变细胞或恶性细胞(NILM)、鳞状上皮内低度病变(LSIL)、鳞状上皮内高度病变(HSIL)患者的HPVDNA阳性率高于HPVE6/E7mRNA阳性率(χ2值分别为20.541、7.446、9.220,均P<0.01),且总体HPVDNA阳性率高于HPVE6/E7mRNA阳性率(χ2=34.389,P<0.01);随着病理分级增加,HPVE6/E7mRNA阳性率、HPVDNA阳性率及mRNA拷贝数上升(χ2/F值分别为77.613、119.863、5175.005,P<0.01),而DNA拷贝数比较差异无统计学意义(P>0.05),宫颈上皮内瘤变(CIN)1级、CIN2级、CIN3级患者中HPVDNA、HPVE6/E7mRNA阳性率比较差异无统计学意义(均P>0.05);观察组阴道镜转诊率低于对照组,患者满意度高于对照组(χ2值分别为50.661、77.647,均P<0.01);HPVE6/E7mRNA联合TCT筛查评估高级别宫颈上皮内瘤变(CIN分级2～3级)及宫颈癌的灵敏度、特异度、准确度高于HPVDNA联合TCT筛查(χ2值分别为39.894、138.474、106.147,均P<0.05)。结论：与HPVDNA联合TCT筛查相比,HPVE6/E7mRNA联合TCT筛查应用在宫颈癌筛查中,灵敏度、特异度更高,并能有效降低阴道镜转诊率,提高患者满意度,值得在临床推广实践。

关键词：
HPVE6/E7mRNA
宫颈癌
液基细胞学检测
筛查
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宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤,高危型人乳头瘤病毒持续感染是其发病的主要原因,早期开展高效筛查有助于预防癌前病变[1]。宫颈液基薄层细胞学检测为宫颈癌筛查的重要手段,但其检测宫颈上皮内瘤变(CIN)2级以上病变的灵敏度及阳性预测值较低,漏诊率高。2016年宫颈癌筛查指南将HPV检测纳入宫颈癌筛查中,虽然能提高筛查的灵敏度、病变检出率,但特异度不足,在检出CIN2+同时也检出无临床意义的HPV感染,使阴道镜转诊与后续随访工作量增加[2]。宫颈癌筛查目的在于检出疾病而非HPV感染,而E6/E7转录及翻译是高危型HPV感染导致宫颈上皮细胞恶性转化的必经之路,因此检测E6/E7较检测HPVDNA有更高的准确性及临床意义[3]。本研究主要分析HPVE6/E7mRNA联合TCT在上海高桥地区宫颈癌筛查中的应用价值。

1、资料与方法

1.1临床资料

选取2017年1月至2018年12月在上海市第七人民医院妇科门诊行宫颈癌联合筛查的女性1925例,纳入标准:①均有阴道分泌物增多、白带异常、宫颈糜烂、接触性出血、宫颈肿物等症状;②尚未接受系统治疗,知情同意取宫颈脱落细胞及宫颈活检组织进行检查;③24h内无性生活且无宫颈放射治疗史。排除标准:①因良性疾病需切除子宫;②有宫颈癌与癌前病变(包括CIN2级、CIN3级)史;③其他妇科恶性肿瘤;④人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及器官移植。依据宫颈筛查方法分为:对照组(HPVDNA+TCT筛查)1050例、观察组(高危型HPVE6/E7mRNA+TCT筛查)875例。对照组年龄30～65岁,平均(47.18±4.96)岁;病程1～3个月,平均(2.41±0.26)个月。观察组年龄31～65岁,平均(47.12±4.99)岁;病程1～3个月,平均(2.46±0.23)个月。两组一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。

1.2研究方法

1.2.1标本采集

受试者均同时留取TCT、HPV标本,取材前3d无阴道冲洗及阴道用药史。采集方法:①采用凯普宫颈细胞收集保存系统与去RNA酶宫颈细胞保存系统采集宫颈细胞标本各1份;②放置阴道扩张器,采用无菌棉球拭去宫颈分泌物;③将新柏氏液基细胞学(TCT)检测专用采样刷放置在宫颈鳞柱状上皮交界处,并顺时针旋转,旋转3～5圈后将采样器前端折断,放置在含专用细胞保存液的专用试管中,室温下保存待测。

1.2.2筛查方法

1.2.2.1TCT筛查

采用膜式液基超薄细胞学和离心沉淀技术,对宫颈脱落细胞进行固定、染色,由检验科医师依据国际癌症协会推荐的Bethesda系统(TheBethesdaSystem,TBS,2001年)进行宫颈细胞学诊断,包括:未见上皮内病变细胞或恶性细胞(NILM)、不能明确意义的非典型鳞状细胞(ASCUS)、不能除外上皮内高度病变的非典型鳞状细胞(ASCH)、鳞状上皮内低度病变(LSIL)、鳞状上皮内高度病变(HSIL)、鳞状细胞癌(SCC)[4]。

1.2.2.2HPVE6/E7mRNA检测

采用聚合酶链式反应(PCR)检测HPVE6/E7mRNA水平,以导流杂交基因芯片技术在TCT结果未知的情况下独立进行检测,可检测15种高危型HPV和7种低危型HPV。将待测标本离心弃去上清液,加入裂解液、蛋白酶K,恒温保存1.5h,取出标本振荡,加入96孔检测板,并设空白对照2孔、阳性质控2孔,经2种捕获探针捕获目的mRNA,采用3级信号放大,加底物及催化剂,进行病毒mRNA杂交,生成支链DNA(bDNA)复合物,以碱性磷酸酶标记的发光探针杂交到固相复合物上,采用突光检测仪检测标本发光值,按拷贝数进行计算,以相对发光强度(RLUs)比≥1诊断为HPVE6/E7mRNA阳性。

1.2.2.3阴道镜检测

转诊阴道镜标准:细胞学≥ASCUS,统计时以TBS≥LSIL及ASCUS/HPV+为标准计算联合筛查的阴道镜转诊率,阴道镜由专职阴道镜医师操作。细胞学与HPV检测均呈阴性者认为无宫颈病变,不必接受阴道镜检查与活检。

1.2.2.4结果判读

由我院经验丰富的病理医师进行细胞学及组织病理学阅片,诊断意见不一致时另请2位高年资病理医师一起阅片,将≥2位病理医师的统一意见作为最终结果。活检结果采用Richart标准分级,分为正常、CIN1级、CIN2级、CIN3级/浸润性宫颈癌。患者满意度评估:应用Zung氏焦虑自评量表系统评估患者焦虑程度,<60分提示无或轻度焦虑,为满意;≥60分提示中重度焦虑,为不满意[5]。

1.3统计学方法

采用SPSS19.0软件对数据进行处理,计数资料以百分比(%)表示,比较采用χ2检验,计量资料以(x±s)表示,行t检验,多组间比较行方差分析及LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组筛查结果比较

观察组HPVE6/E7mRNA初筛阳性率为31.09%(272/875),低于对照组HPVDNA初筛阳性率39.14%(411/1050),χ2=13.535,P<0.01。

2.2不同Bethesda分类患者的HPVDNA及HPVE6/E7mRNA阳性率比较

Bethesda分类中,NILM、LSIL、HSIL患者的HPVDNA阳性率高于HPVE6/E7mRNA阳性率(P<0.01),且总体HPVDNA阳性率高于HPVE6/E7mRNA阳性率(P<0.01),而在ASCUS、ASCH、SCC中HPVDNA阳性率与HPVE6/E7mRNA阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1不同Bethesda分类患者的HPVDNA及HPVE6/E7mRNA阳性率比较[n(%)]

2.3不同病理分级患者的HPVDNA及HPVE6/E7mRNA检测结果比较

随着病理分级增加,HPVE6/E7mRNA阳性率、HPVDNA阳性率及mRNA拷贝数上升(P<0.01),DNA拷贝数比较差异无统计学意义(P>0.05)。进一步两两比较结果显示:CIN3级/ICC患者HPVE6/E7mRNA阳性率明显高于正常、CIN1级、CIN2级患者(χ2值分别为67.481、37.525、37.622,均P<0.05);CIN3级/ICC患者mRNA拷贝数明显高于正常、CIN1级、CIN2级患者(t值分别为117.88、36.503、24.238,均P<0.05);CIN3级/ICC患者HPVDNA阳性率明显高于正常、CIN1级、CIN2级患者(χ2值分别为84.864、78.233、87.488,均P<0.05)。CIN1级、CIN2级、CIN3级患者HPVDNA阳性率、HPVE6/E7mRNA阳性率比较差异均无统计学意义(均P>0.05),见表2、表3。

表2观察组不同病理分级患者的HPVDNA检测结果比较[n(%),x±s]

表3对照组不同病理分级患者的HPVDNA检测结果比较[n(%),x±s]

2.4两组阴道镜转诊率、满意度比较

观察组阴道镜转诊率低于对照组,患者满意度高于对照组(均P<0.01),见表4。

表4两组阴道镜转诊率、患者满意度比较[n(%)]

2.5不同检测方法的筛查价值比较

HPVE6/E7mRNA联合TCT筛查的灵敏度、特异度、准确度分别为37.40%(181/484)、98.72%(386/391)、64.80%(567/875),HPVDNA联合TCT筛查的灵敏度、特异度、准确度分别为19.97%(116/581)、67.59%(317/469)、41.23%(433/1050),见表5。HPVE6/E7mRNA联合TCT筛查评估高级别宫颈上皮内瘤变(CIN分级2～3级)及宫颈癌的灵敏度、特异度、准确度高于HPVDNA联合TCT筛查(χ2值分别为39.894、138.474、106.147,均P<0.05)。

表5两种不同检测方法的筛查价值比较(n)

3、讨论

3.1宫颈癌的诊断及HPVE6/E7mRNA应用前景

HPV感染是宫颈癌发生发展的重要因素,研究证实,HPV基因组早期区编码可干扰细胞周期调控的E6/E7癌蛋白,高危型HPVE6/E7是病毒致癌基因转录产物,参与宿主细胞靶向结合,其表达及转录数量直接决定着细胞恶性转化的可能性[6]。HPVE6/E7mRNA作为有活性的癌基因在宫颈组织中表达,若癌基因无表达,则提示该癌基因无活性,不会发生癌变,因此可依据HPVE6/E7mRNA的表达对宫颈上皮病变进展风险进行有效评估,以更准确地判断宫颈上皮内病变程度与预后[7]。

3.2HPVDNA联合TCT筛查及HPVE6/E7mRNA联合TCT筛查结果

本研究中,1050例女性接受HPVDNA联合TCT筛查,875例接受HPVE6/E7mRNA联合TCT筛查。结果显示,观察组中HPVE6/E7mRNA初筛阳性率为31.09%(272/875),较对照组中HPVDNA初筛阳性率39.14%(411/1050)低,与王娟等[8]报道的406例患者中,HPVDNA阳性率47.0%高于HPVE6/E7mRNA检测阳性率31.2%的结果一致。当前HPV的分子诊断方法主要依赖于对HPVDNA标记物检测,HPV检测是病因学依据,但无法判断出其感染宫颈的具体阶段及癌基因活性程度,而相对来说,HPVE6/E7标记物则能表达癌基因在宫颈组织中的活性,E6蛋白会与P53蛋白、泛素连接酶结合而生成三聚体复合物,导致P53蛋白失去抑癌活性,E7蛋白则可调控多种蛋白并使细胞无限增殖、癌变,且E6、E7蛋白的共同表达可发挥协同作用,增强转化能力,使细胞过度增殖,最终引起宫颈癌的发生,因而HPVE6/E7mRNA可作为一个评估宫颈癌风险的较好指标[9]。

3.3HPVDNA及HPVE6/E7mRNA阳性率与Bethesda分类的关系分析

本研究发现在Bethesda分类中,NILM、LSIL、HSIL患者的HPVDNA阳性率高于HPVE6/E7mRNA阳性率,而总体HPVDNA阳性率也高于HPVE6/E7mRNA阳性率,表明部分HPV感染患者尚未引起宿主细胞的病理改变。在诊断为ASCUS、ASCH、SCC患者中,HPVDNA阳性率与HPVE6/E7mRNA阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05),这与既往文献报道一致[10,11]。因此在筛查出ASCUS及以上患者中,两种方法检测效能相近。

3.4HPVDNA及HPVE6/E7mRNA检测结果与病理分级的关系分析

本研究也显示,随着病理分级增加,HPVE6/E7mRNA阳性率、HPVDNA阳性率增加,且病理分级增加,mRNA拷贝数上升,而DNA拷贝数未发生明显变化,这与李剑等[12]的报道结果相似,提示HPVE6/E7mRNA检测可能具有更高的敏感度,HPV基因与宫颈细胞基因整合是导致CIN转化为宫颈癌的重要原因,宿主感染HPV病毒后,因为HPV病毒过度表达E6/E7而引发免疫逃逸,促进正常细胞逐渐转化为癌细胞[13],且Sotirija等[14]的动物实验也发现HPVE6、E7蛋白过度表达会抑制抑癌基因表达而激活端粒酶,影响细胞周期的调控,使宫颈组织细胞增殖率上升,发生宫颈癌变。近期一项大规模Meta研究(44477例)也发现,HPVE6/E7mRNA检测在宫颈癌筛查中有较高价值,可作为宫颈癌病变启动监测指标,提早发现高级别病变,并进行临床干预[15]。

3.5HPVE6/E7mRNA联合TCT的筛查价值

本研究HPVE6/E7mRNA联合TCT筛查评估高级别宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的患者的灵敏度、特异度高于HPVDNA联合TCT筛查,与既往研究报道一致,且观察组阴道镜转诊率低于对照组,而患者满意度较对照组高,说明HPVE6/E7mRNA联合TCT可能具有更高的筛查价值[16,17]。但两种检测方法的灵敏度仍较低,因此在筛查子宫颈癌中,细胞形态学低敏感性及HPVDNA标记物检测的低特异性均需要提高,采用更具有特异性的方法进行演算而非采用细胞形态学及HPVDNA检测,尤其对于年轻群体,可能选择HPVE6/E7mRNA联合TCT具有更高的筛查价值,国外也有关于推荐采用HPVE6/E7mRNA检测评估宫颈上皮内瘤变患者治疗后的复发风险的研究[18]。

综上所述,HPVE6/E7mRNA联合TCT检测在高桥地区宫颈癌筛查中具有较高临床价值,未来可作为重要辅助检测手段。

参考文献：

[3]叶建红,陈雪红,包丽丽,等.HPVE6/E7mRNA及HPVL1蛋白表达与宫颈病变的关系及其诊断价值[J].中国妇幼健康研究,2018,29(2):170-173.

[5]轩乾坤,郭建,吴文娟,等.人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测的临床应用[J].检验医学,2018,33(7):640-643.

[8]王娟,杨岚,崔彬,等.HPVE6/E7mRNA和HPVDNA作为宫颈癌筛查分子标记物的比较研究[J].海南医学,2016,27(21):3458-3460,3461.

[12]李剑,曲芃芃.HPVE6/E7mRNA与HPVDNA检测在宫颈癌早期筛查中的临床价值[J].天津医药,2016,44(4):466-469.

[15]梁馨元,谢杏美,肖小敏,等.HPVE6/E7mRNA检测在宫颈癌筛查中应用价值的Meta分析[J].实用妇产科杂志,2018,34(6):454-458.

[16]陈颖,林文毅,周萍,等.TCT联合HPVE6/E7在宫颈癌筛查中的应用[J].检验医学与临床,2017,14(15):2216-2218.

秦艳,朱怡.HPVE6/E7mRNA联合TCT检测在宫颈癌筛查的临床应用价值[J].中国妇幼健康研究,2020,31(05):665-670.