近年来，在社会竞争压力增加、生活环境污染、生活习惯改变、晚婚晚育等多种因素的影响下，自然流产的发病率呈现出逐年递增的趋势。自然流产不仅严重影响孕产妇的身心健康[1]，还会给家庭带来深重创痛，严重影响家庭和睦，同时也会给社会稳定带来不安定的因素。因此，对于自然流产的发生及其机制的研究不仅对于维持女性健康妊娠极其重要，还具有积极的临床意义和社会意义。中药苎麻根为荨麻科植物苎麻Boehmerianivea(L.)Gaud.的根，有止血、安胎、清热、利尿的功效[2]。临床上，苎麻根以单味药或复方入药可治疗多种疾病，如苎麻根对于妊娠胎动、子宫出血、习惯性流产等具有显著疗效[3]，它是中医治疗这类疾病的常用药。在我国民间常用苎麻原麻煮水供孕妇服用，以实现对自然流产的防治效果。由此推测，苎麻根治疗自然流产不仅效果显著，且用药安全性也比较高[4]。虽然苎麻根入方剂治疗各种流产由来已久，但这方面的研究甚少，且苎麻根治疗流产的药效成分及作用机制尚不清楚。因此，本研究拟通过网络药理学的分析方法，来预测苎麻根治疗流产的活性成分，相关的潜在蛋白靶点及其涉及的信号通路，并通过构建苎麻根治疗自然流产的活性成分-蛋白靶点-信号通路的网络图并对其可视化，以期为中药多靶点治疗疾病的机制提供方法学参考，并为进一步研究苎麻根治疗自然流产的作用机制提供思路。

1、实验方法

1.1化学成分的收集及候选活性成分的筛选

使用TCMSP平台（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），并结合化学专业数据库及BATMAN数据库[5]收集已发现的苎麻根的所有化学成分；利用TCMSP数据库计算这些化学成分的ADME(absorption、distribution、metabolism、excretion）值（指药物在人体循环系统的吸收情况，并以ADME药代动力学参数评价药物的口服吸收活性。），并对口服生物利用度（oralbioavailability,OB）、类药指数（drug-likeindex,DL）值进行评估，选取OB≥30%,DL≥0.18的化合物作为苎麻根候选活性成分[6]；并利用Pubchem数据库[7]对其分子结构进行确认，最后将其3D结构保存为sdf格式。

1.2保胎潜在靶点的预测

利用SwissTargetPrediction及STITCH数据库[8]对苎麻根候选化合物潜在蛋白靶点进行预测，然后将得到的蛋白靶点导入到UniProt数据库[9]中，筛选得到物种为人的相应的基因靶点。然后利用DiGSeE、GeneCards[10]、TTD等数据库[11]搜索已报道的与流产相关的基因，并搜索文献验证，最后与苎麻根候选活性成分潜在的基因靶点匹配，得到苎麻根候选活性成分的保胎潜在靶点。

1.3网络构建

使用Cytoscape3.6.0软件构建候选蛋白网络互作图，并对网络的度（degree）进行分析。

1.4靶点的生物过程分析和代谢通路分析

使用DAVID[12]，设定阈值p<0.05，得到GO(geneontology）和KEGG(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes）分析结果。

1.5候选活性成分-保胎靶点-通路网络的构建

使用Cytoscape3.6.0软件构建苎麻根候选活性成分-蛋白靶点-信号通路网络以实现苎麻根治疗自然流产的作用机制的可视化。

2、实验结果

2.1苎麻根候选活性成分的获取

收集到的已被发现的苎麻根化学成分共有27种，结果见表1。

表1苎麻根化学成分

由表1根据OB值和DL值筛选得到苎麻根治疗自然流产的活性成分有5种，分别是槲皮素、（+）-儿茶素、丁子香萜、β-谷甾醇和常春藤甙。

2.2苎麻根治疗自然流产的潜在靶点的预测

预测到苎麻根治疗自然流产的相关基因靶点见表2和图1。

表2已报道的苎麻根与自然流产相关的基因

图1苎麻根候选活性成分潜在靶点互作网络图

表2显示，设置0.7的高置信度得到苎麻根候选活性成分治疗自然流产的基因靶点共18个，包括凝血因子II(F2）、白介素6(IL-6）、缺氧诱导因子1α亚基（HIF1A）和血栓调节蛋白（thrombomodulin,THBD）等。图1表示苎麻根候选活性成分的所有潜在基因靶点之间的互作网络，预测到苎麻根候选活性成分的潜在基因靶点共有183个，苎麻根候选活性成分治疗自然流产的基因靶点在图1中红色标示。

2.3KEGG和GO分析

KEGG信号通路分析和GO功能分析结果见表3和图2。

表3苎麻根候选活性成分治疗自然流产的信号通路

KEGG分析结果表明，苎麻根治疗自然流产的相关信号通路主要有7条：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、疟疾、用于IgA生成的肠道免疫网络、HIF-1信号通路、同种异体移植物排斥、补体和凝血级联以及NF-κB信号通路。

图2苎麻根治疗自然流产的相关基因靶点的KEGG分析和GO分析

2.4苎麻根治疗自然流产的候选活性成分-蛋白靶点-信号通路网络

苎麻根治疗自然流产的活性成分-蛋白靶点-信号通路的网络图见表4和图3。

表4苎麻根治疗自然流产的潜在蛋白靶点

图3中黄色节点代表苎麻根治疗自然流产相关的5种候选活性成分，红色节点代表18个苎麻根保胎潜在蛋白靶点，蓝色节点代表苎麻根治疗自然流产可能涉及的7条信号通路，边代表它们之间的相互关联。从图中可以看出，槲皮素治疗自然流产的潜在蛋白靶点最多，包括表4中除PRGR和P12R之外的16个靶点。从图中可看出同一活性成分可对应于不同的靶点，同一靶点也可对应于不同的活性成分，这充分体现了苎麻根治疗自然流产多成分、多靶点的作用特点。

图3苎麻根治疗自然流产的活性成分-蛋白靶点-信号通路图

3、讨论

对于药物的研发和机制的研究不能仅从“单基因-单靶点-单疾病”的“还原论”思维模式进行线性研究，更需要借鉴中医药的诊疗思路，从整体出发，从“多基因-多靶点-复杂疾病”模式着眼，寻求新的研究途径[13]。网络药理学强调疾病的发生发展是一个长期、复杂的动态过程，并认为疾病的本质是复杂生物网络的失衡，中医药的网络药理学是在中医药理论的指导下构建“系统”对“系统”的研究体系，很好的体现了中药整体性观念，即单味中药各化学组分之间以及中药与中药之间治疗疾病的协同作用。

自然流产的发病原因十分复杂，包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、环境因素、免疫因素、血栓前状态以及母体的全身性疾病等[14]，而前人的研究表明，苎麻根可以治疗多种原因引起的流产，例如，苎麻根不仅适用于因血热或跌打损伤、血瘀等引起的胎动不安，还可用于一些病原体引起的胎产诸症[15]。根据本研究预测到的苎麻根候选活性成分保胎主要涉及的7条信号通路来看，符合临床上和报道中苎麻根可以治疗多种原因所致流产的特点。例如，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路是妊娠期糖尿病发病机制的起始和关键[16]；疟疾信号通路与感染所致流产联系紧密[17]；同种异体移植物排斥信号通路是免疫因素引起的自然流产、反复自然流产的发生的重要作用机制之一。另外，本研究预测到，在苎麻根中槲皮素对应的治疗自然流产的靶点最多，槲皮素是一种常见的黄酮类化合物，广泛存在于多种蔬菜、水果等植物性食物中，它能够穿过胎盘屏障，在胎儿体内积聚。根据前人的研究，苎麻根中主要含有蒽醌、黄酮、有机酸类等成分，其原植物提取物具有抗氧化、止血、抗菌等作用[18]，其中，苎麻根黄酮苷对妊娠子宫具有抑制作用[19]，这提示槲皮素在苎麻根治疗自然流产中具有重要作用，但并非此单一成分单独发挥治疗作用。

表4中，本研究中预测到的苎麻根候选活性成分治疗自然流产的蛋白靶点CD40配体与其受体相互作用，诱导多种类型细胞产生促炎因子，如白介素1(IL-1）、白介素2(IL-2）、干扰素γ（IFN-γ）等，在诱发机体免疫应答中发挥重要作用[20]。妊娠是母胎免疫耐受的特定状态，一旦母胎界面免疫耐受出现紊乱，则会导致不良妊娠结局，最常见的表现就是自然流产的发生。由此可见，免疫应答在苎麻根治疗自然流产过程中的重要作用。在人类妊娠早期，预测到的苎麻根治疗自然流产的蛋白靶点孕酮受体被卵巢妊娠黄体产生的孕酮激活后，能够通过调节母体免疫系统，为着床过程准备子宫内膜，维持子宫内妊娠囊[21]。苎麻根候选活性成分治疗自然流产的蛋白靶点组织因子（Tissuefactor,TF）是凝血过程中外源性途径的启动因子[22]，而流产发生时常见症状之一便是孕体出现不同程度的阴道流血，因此凝血过程在苎麻根治疗自然流产时也发挥极其重要的作用。在流产发生时，HIF-1A在血清和绒毛中的低表达可能使滋养细胞转化为侵入型，致使血管生成不足而导致胚胎死亡[23]，由此可见，苎麻根可以通过提高HIF-1α的表达水平来维持正常妊娠；转化生长因子β1(TGF-β1)对胚胎着床、胎盘发育、胎儿生长等各个方面具有重要作用[24]。研究显示，反复自然流产患者会出现PGI2的明显缺乏，其和血栓素（TXA2）之间的平衡对妊娠结局有重要影响[25]；血栓调节蛋白（thrombomodulin,TRBM）普遍存在于血管内皮细胞的表面，通过与凝血酶结合和激活蛋白C系统从而发挥抗凝作用，正常妊娠妇女体内存在着逐渐加重的血管内皮细胞损伤，导致血管内皮细胞分泌的TRBM逐渐增多，其发挥抗凝作用来对抗此时机体的高凝状态从而维持妊娠[26]；正常妊娠过程中，胎盘和蜕膜的凋亡和增殖处于一种平衡状态，一旦出现异常凋亡，打破这种平衡状态，就可能导致病理妊娠的发生，Bax与BCL2的比值增高在自然流产蜕膜和绒毛组织细胞过度凋亡的调节中发挥重要作用[27]，另外有研究表明，乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AC-ES）在凋亡过程中也会大量表达[28]；细胞色素P450(acetylcholinesterase,CYP)是一组由结构和功能相关的基因超家族编码的同工酶组成的超家族酶系。细胞色素P450的同工酶3A4(CP3A4）是人体最重要的药物代谢酶，它是参与口服药物首过效应的最重要的单体酶[29]。由此可以看出，苎麻根治疗自然流产是通过免疫、凝血、凋亡，神经系统调控等几个方面进行的（表4）。

临床上对于自然流产的治疗，西医主要选择卧床休息，或者补充黄体酮等药物来辅助治疗，治疗途径较为单一，效果不佳且长期使用有致畸等副作用[30]。而中医则从通过辨证论治，使用中药复方进行保胎，从保胎优生角度来看，效果明显优于黄体酮[30,31,32]。其中，中药苎麻根既可以食用，也可以入药用，可以预测其保胎安全性比较高，所以对其保胎作用进行研究，对于苎麻根的综合开发利用以及自然流产的有效治疗具有重要意义。本研究通过网络药理学预测到苎麻根治疗自然流产相关的物质基础与作用机制，能够对从整体上研究苎麻根治疗自然流产的作用机制有一定的参考价值，但由于此方法存在数据可能不完整，以及产生这些数据的文献的可靠性等诸多问题，所以要最终揭示苎麻根治疗自然流产的分子机制还需要通过大量的实验进行验证。

4、小结

苎麻根对于多种原因所致自然流产具有很好的保胎作用，本研究预测了苎麻根治疗自然流产的候选活性成分和相应的保胎蛋白靶点，以及保胎所涉及的信号通路，较为全面直观地解释了苎麻根治疗自然流产的药效基础和作用机制，这对于进一步的实验验证、临床保胎用药以及苎麻根相关产品的开发具有一定的参考价值。

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