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观察分析CDKN2B-AS1基因多态性与子宫内膜异位症的关系

2020-07-08 278 上传者：管理员

摘要：目的:研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B-反义RNA(CDKN2B-AS1)基因多态性与子宫内膜异位症(EM)的相关性。方法:选择2017年12月至2019年7月邯郸市中心医院和河北医科大学第四医院收治的子宫内膜异位症的患者112例为病例组，另取同期因宫外孕、输卵管黏连等手术患者112例为对照组，采用DNA PCR测序法检测所有受试者血液CDKN2B-AS1基因多态性，分析CDKN2B-AS1基因rs10965235位点多态性与EM临床分期的关系，采用Logistic回归分析CDKN2BAS1基因多态性对EM易感性的影响。结果:病例组与对照组年龄、BMI、月经周期、CDKN2B-AS1rs4977574位点等位基因A与G、AA与AG+GG基因型频率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。CDKN2B-AS1基因rs4977574位点与AA基因型比较，AG+GG基因型与EM易感性无关(OR=1.105,95%CI:0.819-1.491; P=0.124)。与对照组比较，病例组CDKN2B-AS1基因rs10965235位点等位基因C、CC基因型频率高，等位基因A、CA+AA基因型频率低(χ2=4.397、4.075,P=0.036、0.044)，差异有统计学意义。与Ⅰ～Ⅱ期比较，III～IV期EM患者CDKN2B-AS1基因rs10965235位点CC基因型频率高、CA+AA基因型频率低，差异有统计学意义(χ2=5.168,P=0.023)。CDKN2B-AS1基因rs10965235位点，与CC基因型比较，携带CA+AA基因型可降低EM易感性(OR=0.564,95%CI:0.347-0.917,P=0.000)。结论:CDKN2B-AS1基因rs4977574位点与EM易感性无关，rs10965235位点基因多态性与中国北方女性EM易感性有关。

关键词：
基因多态性
子宫内膜异位症
细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B-反义RNA基因
育龄妇女
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细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B-反义RNA基因;基因多态性;子宫内膜异位症;

子宫内膜异位症(endometriosis,EM)常发于育龄妇女，发病率为10%-15%，其在不孕者中发病率高达25%～40%，且呈逐年上升趋势，严重影响女性生活质量及生育功能[1]。但其发病机制尚不清楚，相关研究认为，EM是一种雌激素依赖性疾病，且其易感性有一定遗传性和家族聚集倾向[2]。基因单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)是常用遗传学标记，临床可用于分析复杂基因遗传特性[3]。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2B-反义RNA基因(cyclindependent kinase inhibitor 2B antisense RNA1,CDKN2B-AS1)位于9p21.3染色体，研究证实其rs4977574位点与冠心病、动脉粥样硬化性疾病等有关，其rs10965235位点与EM可能有关，但目前关于CD-KN2B-AS1多态性与EM关系报道尚少[4]。因此，本研究拟探究CDKN2B-AS1 rs4977574位点、rs10965235位点与中国北方女性EM易感性的关系，以期为EM发病遗传机制深入研究提供一定参考依据。现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料:

选择2017年12月至2019年7月邯郸市中心医院和河北医科大学第四医院收治的子宫内膜异位(EM)患者112例为病例组，年龄22～45岁，平均年龄(33.16±6.13)岁，月经周期28～32d，平均(30.19±1.36)d，平均身体质量指数(Body Mass Index,BMI)为(24.69±1.97)Kg/m2。根据美国生殖医学协会制定的(r-AFS)分期标准[5],EM患者Ⅰ～Ⅱ期39例，Ⅲ～Ⅳ期73例。另取同期因宫外孕、输卵管黏连等手术患者112例为对照组，年龄22～45岁，平均年龄(33.74±5.91)岁，月经周期28～32d，平均(29.94±1.23)d，平均BMI为(24.32±1.68)Kg/m2，两组受试者年龄、BMI、月经周期比较差异无统计学意义(P均>0.05)，具有可比性。本研究经过邯郸市中心医院伦理委员会批准通过，收集受试者所有临床资料，所有样品采集及资料调查均取得患者及其家属知情同意并签字确认，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2纳入与排除标准:

纳入标准:(1)均符合EM相关诊断标准;(2)患者均无亲缘关系;(3)均为22～45岁间适育龄女性。排除标准:(1)术前3个月有激素或其他药物治疗史;(2)有子宫、卵巢手术史或遗传病史者;(3)合并严重心、肝、肺或其他重要脏器功能障碍者;(4)合并恶性肿瘤者;(5)合并先天性子宫畸形或放置宫内节育器者。

1.3方法

1.3.1标本采集:

采集所有受试者清晨空腹静脉血5mL，于-80℃冰箱保存待检。

1.3.2 PCR扩增及应基因型检测:

采用DNA提取试剂盒(货号:158422，英国QIAGEN)提取受试者血液DNA,CDKN2B-AS1 rs4977574上游引物序列(5'→3'):GGG TTA TGG GAA ATG CCA TG，下游引物序列(5'→3'):TTG CTG AAG GGA CTC AAT GAG AG;CD-KN2B-AS1 rs10965235上游引物序列(5'→3'):CGT ACG CGG TTC TCT GAC CCG GTC CCT CGG C，下游引物序列(5'→3'):CAT CCA GCG AGC AGT GCA GCC AGC ATT CCT GG;引物由上海生工生物科技有限公司合成。PCR反应体系(25 L):混池DNA 1.0 L,2×Primer STAR GC Buffer 12.5 L,d NTP 2.0 L,Primer STAR HS DNA Polymerase 0.25 L,ddH2O 9.25 L。反应条件:95℃5 min;98℃15s;64℃1 min;72℃，30s,35个循环;72℃10 min。PCR产物纯化回收(DNA纯化回收试剂盒货号:DP214-3，北京天根生化科技有限公司)后送上海生工生物科技有限公司测序。采用Chroms 1.62软件读取测序峰图。

1.4统计学分析:

采用SPSS19.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验;计数资料采用n(%)表示，比较行χ2检验或Fisher确切概率法;采用Logistic回归分析CDKN2B-AS1基因多态性与EM易感性的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组受试者一般资料比较:

与对照组相比，病例组年龄稍小、BMI稍高、月经周期稍长，但两组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，详见表1。

表1两组受试者一般资料比较

2.2两组受试者CDKN2B-AS1等位基因及基因型频率比较:

对照组与病例组患者CDKN2B-AS1基因rs4977574、rs10965235位点基因型和等位基因频率分布均符合哈代-温伯格遗传平衡定律，具有群体代表性。病例组与对照组CDKN2B-AS1基因rs4977574位点等位基因A与G、AA与AG+GG基因型频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，病例组CDKN2B-AS1基因rs10965235位点等位基因C、CC基因型频率高，等位基因A、CA+AA基因型频率低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2两组受试者CDKN2B-AS1等位基因及基因型频率比较n(%)

表3 CDKN2B-AS1基因rs10965235位点多态性与EM临床分期的关系n(%)

2.3 CDKN2B-AS1基因rs10965235位点多态性与EM临床分期的关系:

与Ⅰ～Ⅱ期比较，Ⅲ～Ⅳ期EM患者CDKN2B-AS1基因rs10965235位点CC基因型频率高、CA+AA基因型频率低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4 Logistic回归分析CDKN2B-AS1基因多态性与EM易感性的关系:

CDKN2B-AS1基因rs4977574位点与AA基因型比较，AG+GG基因型与EM易感性无关(OR=1.105,95%CI:0.819-1.491;P=0.124);CD-KN2B-AS1基因rs10965235位点，与CC基因型比较，CA+AA基因型可降低EM易感性(OR=0.564,95%CI:0.347-0.917,P=0.000)，见表4。

表4 Logistic回归分析CDKN2B-AS1基因多态性对EM易感性的关系

3、讨论

EM是指具有生物活性的子宫内膜组织出现在子宫腔以外其他部位，且存在增生、转移及高复发等恶性肿瘤性行为，临床主要表现为继发性痛经、慢性盆腔痛和不孕等，不仅影响患者生活治疗及生育功能，还给患者家庭及社会带来严重经济负担[6]。目前临床EM确诊率很低，CA125、CA19-9、TNF-α等指标可协助EM诊断，但特异性不强，预测EM疾病发生能力差，往往导致病情延误;另病理检测因其有创性导致患者接受度不一，临床应用受限。近来研究报道，全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)可筛查出有效疾病形状关联的SNP，可检测低频突变信息，且灵敏度和特性度高[7]。本研究以及因多态性为切入点研究CDKN2B-AS1基因多态性与EM的相关性可能为临床EM发病机制研究及诊疗提供一定参考。

多项研究证实EM受遗传因素影响。赖曾珍等[1]研究报道，Toll样受体4(TLR4)受体基因多态性与EM有关，且纯合子Asp299Gly基因型和Thr/Ile基因型可增加EM易感性，其检出率在EMⅢ～Ⅳ期中显著增加。Wang等[8]研究报道，白细胞介素-10(IL-10)基因多态性与EM易感性有关，IL-10-819T/C位点和-592A/C位点等位基因或基因型频率高，且与EM患者临床分期有关。近来随着基因多态性的深入研究，基因多态性与EM易感性的关系备受关注。CDKN2B基因产物是一种肿瘤抑制因子，可调控细胞周期、延缓细胞增殖，CDKN2B-AS1基因为其反义RNA，基因全长126.3Kb，其表达水平升高亦与细胞增殖、黏附增加等有关[9]。乔林等[4]研究报道，CDKN2B-AS1基因rs4977574位点SNP与女性早发冠心病及高血红蛋白有关，其中GG、GA基因型携带者早发冠心病发生率显著增加。Kunnas等[10]研究报道，CDKN2B-AS1基因rs4977574位点GG基因型与冠心病风险增加有关，而可降低高血压易感性。Lee等[11]研究报道，CD-KN2B-AS1基因rs10965235位点SNP与韩国女性EM易感性有关，其中携带CA、AA基因型EM易感性低，CC基因型携带者EM易感性高且EM临床分期亦高。本研究结果发现，与对照组比较，EM患者rs4977574位点等位基因A、G、GG、AG+AA基因型频率差异无统计学意义，且与EM易感性无关，可能因选择病例存在地域差异或疾病异质性，CDKN2B-AS1基因rs4977574与EM易感性无相关。本研究结果还发现，与对照组比较，病例组CDKN2B-AS1基因rs10965235位点等位基因C、CC基因型频率高，等位基因A、CA+AA基因型频率低，且与EM临床高分期及EM易感性有关，提示CDKN2B-AS1基因rs10965235位点SNP可能与EM易感性及疾病进展有关，CC基因型可增加EM易感性并与疾病分期高有关，A等位基因可能为保护基因，携带A等位基因可能降低EM易感率，但有文献报道，这种相关性也可能因rs10965235位点SNP与周围基因存在连锁不平衡而检测不到，而本研究并未关注rs10965235是否可能出现连锁不平衡、连锁互换等反应，因此后期仍需加大样本量进一步深入探究。

综上所述，CDKN2B-AS1基因rs4977574位点与EM易感性无关，rs10965235位点基因多态性与中国北方女性EM易感性及临床分期有关，CC基因型可增加EM易感性，携带A等位基因可能降低EM易感性。但由于本研究样本量少，选择样本范围小，另因地理差异导致结果存在局限性，后期应加大样本量、增加选择范围进一步深入探究。

参考文献：

[1]赖曾珍,徐志红.TLR4受体基因多态性与子宫内膜异位症相关性探讨[J].标记免疫分析与临床,2017,24(6):631~634.

[3]阳鑫妙,李雯雯,沈国松,等.42例自然流产组织的单核苷酸多态性微阵列芯片分析[J].中华医学遗传学杂志,2019,36(4):400~402.

[4]乔琳,文星艳,窦克非,等.CDKN2B-AS1基因多态性与女性早发冠心病的相关性研究[J].中国循环杂志,2017,32(12):1154~1157.

[9]郑中华,季慧慧,陈楚嘉,等.健康人群CDKN2A和CD-KN2B基因甲基化水平与衰老的相关性[J].南方医科大学学报,2019,39(6):724~730.

郝娜,贾亚静,田芸婕,路晓琳.CDKN2B-AS1基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究[J].河北医学,2020,26(06):975-980.

基金:河北省医学科学研究课题计划项目,(编号:20191838).