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桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病的潜在通路与物质基础

2020-10-13 422 上传者：管理员

摘要：目的：探索桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病的潜在通路与物质基础。方法：通过数据库联用与文献挖掘检索桂枝茯苓丸主要活性成分及其作用靶点、子宫腺肌病相关靶蛋白，使用Cytoscape3.2.1软件绘制蛋白质相互作用网络图，结合网络特征分析网络关键靶点，并将其投射到KEGG与GO数据库中进行通路富集分析。结果：共得到90个活性成分、165个成分作用靶点、78个疾病靶蛋白。经网络药理学分析，得到MAPK与PI3K/AKT两条潜在通路，丹皮酚、芍药苷等16个潜在物质基础。结论：桂枝茯苓丸中的丹皮酚、芍药苷等有效成分可能通过MAPK通路与PI3K/AKT通路抑制异位内膜组织生长、侵袭与黏附，达到治疗子宫腺肌病的目的。

关键词：
妇产科
子宫腺肌病
桂枝茯苓丸
网络药理学
芍药苷
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子宫腺肌病是具有肿瘤的远隔侵袭能力且复发率较高的妇科疑难病，临床发病率为5%～70%[1,2]。目前，临床多以促性腺激素释放激素、孕激素及其拮抗剂、雄激素类衍生物和手术方法治疗，但其术后2年复发率为36%，治疗效果不佳[3,4]。

桂枝茯苓丸由桂枝、赤芍、茯苓、牡丹皮、桃仁五味药组成，具有消癥散结、化瘀生新、调和气血的功效。临床研究表明，米非司酮联合桂枝茯苓丸对血瘀型AM的治愈率优于单纯使用米非司酮，单用桂枝茯苓丸对AM的疗效优于孕三烯酮[5,6]。实验发现，桂枝茯苓丸可以抑制异位内膜的生长与血管生成，抑制肿瘤细胞的增殖、黏附与侵袭，达到治疗AM的效果[7,8,9]。

目前，对桂枝茯苓丸的研究以临床研究多见，尚缺乏分子作用机制报道。本研究运用网络药理学方法研究桂枝茯苓丸有效成分治疗AM的分子作用机制，为临床运用桂枝茯苓丸治疗AM提供理论依据。

1、方法

1.1分子和靶蛋白的收集与处理

1.1.1桂枝茯苓丸主要成分及靶蛋白的收集与处理

使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCM-SP）对桂枝茯苓丸主要化合物成分进行筛选，筛选条件：生物口服利用度≥30%，类药性≥0.18。并通过化学数据库检索与综述文献整理[10,11,12]，将现已证实确有药效的化合物补充进数据集。

在TCMSP中查询候选化合物的作用靶点并在Uniprot中将蛋白名转化成基因名，同时在有机小分子生物活性数据库（Pubchem）中查询其3D结构，导入SwissTargetPrediction数据库中进行靶蛋白预测。在蛋白质数据库（PDB）中查询得到靶点的PDBID，在SystemsDock数据库中进行靶点-结构的分子对接，取对接得分为5分以上的靶蛋白，将两次得到的靶蛋白取并集，作为桂枝茯苓丸有效成分的作用靶点。使用Cytoscape3.2.1软件绘制中药-成分-靶点关系网络。

1.1.2AM疾病靶蛋白收集与处理

在基因表达综合数据库（GEO）、基因关联数据库（GAD）中以“adenomyosis”为关键词对AM进行检索，并通过文献补充[13,14,15,16,17]，去重后，得到AM疾病靶点。

1.2网络构建与核心靶蛋白富集分析

1.2.1网络构建与核心靶点筛选

使用Cytoscape3.2.1软件中的BisoGenet插件绘制AM疾病靶点与桂枝茯苓丸有效成分的蛋白质相互作用图（PPI），并使用Merged工具将得到的两个网络取交集，借助NetworkAnalyser工具与CytoNCA工具对网络属性及网络节点的拓扑属性进行分析，并以大于节点的“度”和“介数”的平均值为条件筛选核心靶点网络，得到核心中药-靶点-疾病网络。

1.2.2核心靶点的富集分析

将核心靶点名称导入David数据库中，对其进行GO注释与KEGG通路富集分析，分析结果导入Excel工作表中，按照P<0.05的标准筛选富集结果。

2、结果

2.1中药有效成分、靶点筛选结果及PPI

对桂枝茯苓丸的成分及靶点检索共得到候选化合物90个，靶蛋白165个，如图1所示，紫色、红色、浅蓝色、橙色、黄色节点分别为桂枝、桃仁、赤芍、茯苓、牡丹皮有效成分候选化合物，深蓝色节点为候选化合物作用靶点，绿色节点为中药。

图1桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病中药-成分-靶点关系网络图

2.2疾病靶点筛选及网络绘制结果

对AM疾病靶点检索，去重后共得到78个靶蛋白（见表1），绘制PPI。与中药-成分-靶点关系网络取交集后，分析得到节点“度”和“介数”的平均值分别为44.88564和0.00069，选择“度”≥44.88564且“介数”≥0.00069的278个关键靶点绘制核心中药-靶点-疾病网络，如图2所示，三角形与椭圆分别为中药成分靶点与疾病靶点。

2.3通路富集分析结果

共得到118个生物通路，其中主要通路包括细胞周期、细胞凋亡、雌激素信号通路等27个（见表2）；得到193个生物过程，其中主要生物过程包括细胞增殖与凋亡、细胞黏附、细胞周期等44个（见表3）；得到73个分子功能，包括蛋白质结合、酶结合、雌激素受体结合等（见表4）。

在Excel表中，使用数据透视工具对27个主要通路所涉及的靶点进行分类汇总并统计频数，平均频数为3.89，选择平均频数≥4的靶点为核心通路靶点，共得到80个关键通路靶点（见表5），频数最高的五个靶点为MAPK1、MAPK3、AKT1、PI3KR1、PI3KR2。结合KEGG通路富集结果，推测MAPK通路、PI3K/AKT通路为桂枝茯苓丸治疗AM的部分可能通路。

表1子宫腺肌病疾病靶点

图2桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病核心中药-靶点-疾病网络图

将80个关键通路靶点映射到核心中药-靶点-疾病网络中，共得到有效化合物18个（见表6）。

3、讨论

AM由离经之血蓄积于局部，留滞胞宫，成为瘀血而致病，属中医学癥瘕、痛经、月经过多等范畴。血瘀是AM的核心病机，活血化瘀消癥为其治疗大法。根据本研究对桂枝茯苓丸治疗AM的成分-靶点网络分析结果可知，方中桂枝、桃仁、牡丹皮的作用靶点最多，且存在多种中药共同作用于同一靶点的情况。这与桂枝为君、温通血脉以行瘀滞，桃仁、牡丹皮活血破瘀、散结消癥，牡丹皮凉血以清瘀久所化之热的组方方义相吻合。多种中药存在协同作用靶点，又体现了本方配伍之严谨与巧妙，诸药合用，共奏活血化瘀、缓消癥块之功。临床实验显示，桂枝茯苓丸可有效改善患者性激素水平，缩小子宫体积，改善痛经程度，减少月经量，并可降低AM患者血清糖类抗原125(CA125）水平及局部子宫组织的血管生长因子（VEGF）、雌二醇（E2）与前列腺素2(PGE2）水平[18,19]。

研究表明，AM病理过程中子宫内膜碎片的黏附、侵袭以及血管形成符合恶性肿瘤的病理过程[20]。本研究预测的MAPK与PI3K/AKT通路均与细胞生长关系密切，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[21]，与恶性肿瘤的增殖、转化、转移，细胞凋亡与增殖，以及细胞周期调节等关系密切[22,23,24]。动物实验发现，异位内膜组织中MAPK与PI3K/AKT的表达均显著高于在位内膜，且在位内膜组织又显著高于正常内膜细胞，提示MAPK与PI3K/AKT均可能参与AM的发展过程[25,26]。

表2桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病KEGG富集通路

表3桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病生物过程

表4桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病相关分子功能

MAPK家族包括c-Jun氨基末端激酶（JNK）、P38蛋白（P38）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）等多种交互通路。其中P38/MAPK磷酸化在细胞凋亡中起重要作用[27];MAPK/ERK可靶向运输细胞外的底物，控制线粒体裂变代谢和细胞存活，加快细胞分裂和细胞周期进程[28]。MAPK信号通路还可将细胞外刺激传递进细胞内，进而介导细胞反应[29]。通过抑制MAPK信号通路，可降低细胞周期素依赖性激酶、细胞周期素B1、黏着斑激酶含量，从而降低肝癌HepG2细胞侵袭与转移能力[30]。实验显示，桂枝茯苓丸可以下调MAPK通路，降低患者血清VEGF、E2及孕酮（P）水平，抑制细胞分裂及异位内膜的增殖[31]。阻断MAPK通路可明显抑制TGF-α及细胞增殖[32]，进一步证明MAPK通路可能是桂枝茯苓丸治疗AM的关键通路之一。

表5桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病关键通路靶点

表6桂枝茯苓丸治疗子宫腺肌病有效化合物

PI3K与AKT均有三个亚型可参与胞液运输及细胞自噬过程[33,34]。AKT1可通过降低细胞凋亡率促进细胞存活，并在蛋白质合成过程中发挥作用[35]。PI3K可与AKT非特异性结合，通过环腺苷酸（cAMP）激活AKT,cAMP又与P38/MAPK呈正相关，介导多种细胞功能[36,37]。此外，PI3K/AKT通路与肿瘤细胞存活及血管生成关系密切[38]。有研究表明，桂枝茯苓丸可下调大鼠PI3K/AKT的表达，调节AM中异位内膜的上皮-间质转化，抑制体外AM细胞的迁移率[39,40]。应用PI3K/AKT阻断剂可下调癌细胞尿激酶型纤溶酶原激活因子、基质金属酶-2(MMP-2）、MMP-9水平，并上调金属蛋白酶类组织抑制剂-2水平，抑制癌细胞的黏附和侵袭能力[41]。

在本研究中，将得到的80个关键靶点投射到中药-成分-疾病PPI网络上，得到紫杉醇、丹皮酚等18个有效化合物。有实验通过对桂枝茯苓胶囊的质谱碎片裂解信息比对，分离出桂枝茯苓胶囊的23个入血成分[42,43,44]，其中包含本研究所得的丹皮酚与芍药苷，这两种成分可被直接吸收入血，发挥药性作用，苯甲醛经氧化代谢后可生成苯甲酸，均对肿瘤细胞的增殖、转移与血管生成有抑制作用[44,45]。此外，其他成分如紫杉醇等，现代药理研究已证明其具有抑制肿瘤发生发展与转移的作用[46]。

MAPK通路与PI3K/AKT通路均可介导多种细胞活动，从而调节肿瘤的生长、侵袭与黏附。但由于网络药理学的技术限制，本研究所得的通路相关性及重要性不宜用频次决定，其他通路及靶点也可能是桂枝茯苓丸治疗AM的关键，与本研究所论述的MAPK通路和PI3K/AKT通路具有同样的研究价值。已有研究显示，RHOA/ROCK在肿瘤中有异常表达，通过参与上皮间质转化，介导肌动蛋白表达，调控肿瘤细胞的迁移与侵袭过程，对AM亦有潜在的治疗作用[47,48]。

综上，本研究通过网络药理学分析得出桂枝茯苓丸中的丹皮酚、芍药苷、紫杉醇等可能通过抑制MAPK通路与PI3K/AKT通路实现对异位内膜组织的抑制，从而治疗AM。同时，桂枝茯苓丸仍可能通过其他通路及靶点对AM发挥治疗作用，但是目前尚缺乏相关实验证据，其具体机制还需进一步实验验证。

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