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血清TMT标记定量蛋白质组学对多囊卵巢综合征病因研究

2021-11-01 81 上传者：管理员

摘要：目的通过应用串联质谱标签(tandemmasstag,TMT)联合液相色谱-串联质谱(liquidchromatography/tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)技术、差异表达蛋白及其相关生物通路对多囊卵巢综合征(polycysticovariansyndrome,PCOS)患者病因研究。方法本研究纳入20例PCOS患者作为PCOS组,18例正常女性作为对照组。通过TMT联合LC-MS/MS检测所有研究对象的空腹血清样本,对数据进行统计学和生物信息学分析。结果鉴定了38个差异表达蛋白质,其中21个蛋白在PCOS中表达上调(FC≥1.2,P<0.05),17个在PCOS中表达下调(FC≤0.83,P<0.05)。采用京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)和Reactome对差异表达蛋白进行富集分析,分别富集到18个和78个通路。将两个数据库富集分析结果整合,均发现补体级联反应的富集通路,共同涉及的差异表达蛋白为甘露糖结合蛋白(mannose-bindingprotein,MBL)。结论PCOS患者体内可能存在补体系统的过度激活,差异蛋白MBL可能是其中的关键致病因子。

关键词：
PCOS诊断标准
串联质谱标签
多囊卵巢综合征
甘露糖结合蛋白
蛋白质组学
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多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,PCOS)是妇科内分泌疾患中一种高发病率、高异质性表现及高风险远期并发症[1]的疾病。有研究表明，其在育龄期妇女中的发病率高达6%～21%[2]。主要表现为稀发排卵和(或)无排卵、临床和(或)生化表现为高雄激素(hyperandrogenism,HA)、卵巢多囊改变、代谢异常如胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)、肥胖、脂代谢异常等，还存在如心血管疾病、子宫内膜癌前病变及子宫内膜癌等高风险远期并发症[1]。

PCOS的诊断标准在全世界范围尚未统一，其病因和发病机制一直尚未明确。最新的诊断标准有以证据为基础的2018年PCOS评估和管理的国际循证指南[3],以及根据我国患病人群特征修正的2018年PCOS中国诊疗指南[4]。两个指南以及既往的一些经典指南对于PCOS的诊断各有区别。目前在我国仍以应用2003年欧洲人类生殖及胚胎学会/美国生殖医学会提出鹿特丹诊断标准最为普遍。现有研究表明PCOS患者外周及卵巢存在炎症细胞因子的异常表达、或存在免疫细胞浸润，进而诱导免疫功能紊乱，免疫紊乱会影响PCOS患者性激素水平、妊娠和妊娠结局[5],也可通过相关途径诱导IR、高HA及肥胖的发生，促进PCOS的发生和发展[6,7]。

随着蛋白质组学技术的发展，越来越多的研究者利用高通量定量蛋白质组学对疾病的发病机制或发生发展过程进行研究，其中串联质谱标签法(tandemmasstag,TMT)可以对肽段进行精确鉴定和定量比较。而TMT技术在PCOS的研究中应用较少，因此，本研究利用液相色谱-串联质谱(liquidchromatography/tandemmassspectrometry,LC-MS/MS)分析联合TMT技术，寻找PCOS血清特异性蛋白质，探讨PCOS可能的发病机制，为临床上PCOS的诊断与治疗提供实验室依据。

1、对象与方法

1.1 对象

选择2019年12月—2020年8月在湖南省妇幼保健院门诊就诊的21～35岁共20例PCOS患者，平均年龄(25.85±4.50)岁。PCOS诊断参照2003年鹿特丹诊断标准[8]:①稀发排卵或无排卵(月经周期大于等于35d);②高雄激素的临床和/或生化表现；③卵巢多囊样改变[超声提示一侧或双侧卵巢直径2～9mm的卵泡≥12个，和(或)卵巢体积≥10ml];④三项中符合两项并排除其他高雄激素疾病，如先天性肾上腺皮质增生、库欣综合征和分泌雄激素的肿瘤等。选择同期相同年龄范围的18例来本院体检的健康正常妇女作为正常对照组，平均年龄为(26.00±4.21)岁，并符合以下标准：月经周期规则，无肥胖、多毛、痤疮及血糖血脂均正常，体质指数正常。所有研究对象均为汉族女性，就诊及测定激素之前3个月以上未使用过任何激素类药物和避孕药，既往无肾脏疾病、甲状腺疾病、糖尿病、库欣综合征等病史。两组年龄差异无统计学意义(t=0.11,P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器

胰蛋白酶、二硫苏糖醇、IAm均购于美国Promega公司，乙腈、甲醇购于美国FisherScientific公司，丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠、四甲基乙二胺购于美国SIGMA公司，TMT试剂购于美国ThermoFisherScientific公司，C18液相色谱柱购于美国Phenomenex公司。质谱仪购于美国ThermoFisherScientific公司，离心机购于德国Eppendorf公司。

1.2.2 标本采集及保存

PCOS组患者于月经来潮的第2～4d或者闭经任意时间段采血，激素水平提示早卵泡期水平，正常对照组为检查当日采血，两组均在禁食12h后于早晨9∶00-10∶00抽取静脉血。所有研究对象抽取的静脉血在4℃静置1h,离心半径13.5cm、4℃下3000r/min离心5min后分离血清，-80℃冰箱保存备用。所有血清标本在质谱分析前避免反复冻融。本研究经湖南省妇幼保健院伦理委员会审批，所有参与者均签署知情同意书。

1.2.3 实验步骤

首先用ProteinMiner柱去除血清中高丰度蛋白，提取富集的低丰度蛋白用胰蛋白酶酶解成肽段，然后用乙腈溶解好的标记试剂加入肽段中，不同样品用不同大小的同位素标记。再将标记好的肽段在C18离子交换柱中进行分馏，将馏分加入Q-Exactive质谱分析仪中进行检测。质谱扫描完毕，得到质谱原始文件，将质谱原始文件输入到PD(ProteomeDiscoverer1.4,thermo)软件，对质谱图进行筛选。PD软件提取后的谱图用Mascot软件(版本：2.3.01)进行搜索，搜索结束后，PD软件根据Mascot搜索结果和第一步筛选后的谱图进行定量分析。

1.2.4 实验过程质量控制

为保证蛋白定量准确性，采用适合于样品缓冲体系及浓度范围的定量方法，标准曲线R2应大于0.99。SDS-PAGE检测时，样品之间要求相对一致。SDS-PAGE检测蛋白质量，要求条带清晰，无降解。酶解后大部分肽段长度小于30个氨基酸。

1.2.5 差异蛋白筛选及生物信息学分析

设定差异倍数≥1.2或差异倍数≤0.83且P<0.05的蛋白为差异蛋白质[9]。筛选出的差异蛋白质采用京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,KEGG)[9]及Reactome数据库分析富集通路[10],找到差异表达蛋白主要参与的生物通路。

1.3 统计学分析

应用SPSS25.0软件进行统计学分析。呈正态分布的计量资料以x¯±s表示，对每种蛋白在PCOS组和正常对照组的定量值进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PCOS患者血清总蛋白及差异蛋白

在人类UniProt数据库(172261序列)中对质谱数据进行蛋白鉴定和分析，共鉴定出718种蛋白，计算各种蛋白在PCOS组和正常对照组两组样本间表达量的差异倍数(foldchange,FC)。鉴定了38个差异表达蛋白质，见表1,以差异倍数≥1.2且P<0.05的蛋白为条件筛选上调蛋白，以差异倍数≤0.83且P<0.05条件筛选下调蛋白，得到PCOS组上调表达蛋白21种，下调表达蛋白17种。对718种鉴定出的蛋白进行分析，分别以log2(FC)为横轴，以-log10(P.Value)为纵轴，对蛋白绘制火山图，上调蛋白(红色)和下调蛋白(绿色)有明显的区分度。见图1。

2.2 差异蛋白质的富集通路分析

对38个差异表达蛋白进行KEGG和Reactome富集通路分析，结果显示，在KEGG中发现18个富集通路，主要涉及补体系统和血液凝固级联活化途径、人类相关疾病(疟疾、人乳头瘤病毒感染、致心律失常性右室心肌病等)、细胞活动相关(吞噬体、粘着斑、细胞外基质受体相互作用等)、信号通路(PI3K-Akt信号通路、p53信号通路糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白生物合成等)。在Reactome数据库中富集了78个通路，结果以参考P值(P<0.05)、富集比例(该通路上注释的差异蛋白数目/该通路上注释的背景蛋白数目)、该通路上注释的差异蛋白数目3个条件，共9条显著性富集通路。见图2。

将KEGG及Reactome两个数据库中发现的富集通路整合，发现均存在补体级联反应通路，在KEGG中为上调的差异蛋白甘露糖结合蛋白(mannose-bindingprotein,MBL)及血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂(plasmaserineproteaseinhibitor,PCI/IPSP)参与补体级联反应通路，而在Reactome数据库中补体级联反应通路涉及的差异蛋白包括MBL和免疫球蛋白重链恒定区γ2(IGHG2)。见图3。

3、讨论

PCOS的病因及发病机制一直以来都是研究的热点，研究手段也不尽相同，主要包括基因组学、代谢组学、蛋白质组学等。机体生理功能的实际执行者即蛋白质，其在疾病中的变化，具有提示该疾病的发病机制或病理生理作用，蛋白质组学既是利用这一点，通过探索细胞内蛋白质的功能活动及相互作用，为寻找疾病的发病机制及诊疗方法提供新的技术手段[11]。在众多标本中，血标本最易采集，故如能在血液中找到PCOS临床生物标记物，将为PCOS的诊断及治疗有着巨大推进作用。

在本研究中，通过对PCOS组和正常对照组的血清进行蛋白质组学分析，共发现38种差异蛋白质，将其进行KEGG及Reactome的反应通路富集分析，均发现补体级联反应信号通路的显著性。既往也有研究者通过定量蛋白质组学对肥胖PCOS及非肥胖PCOS患者的血清标本进行研究，同样发现其血清差异蛋白显著参与的共同途径为补体和凝血级联信号通路途径[12],与本文研究结果一致。

近期，国外有学者发现PCOS患者补体因子明显高于健康对照组[13],提示PCOS患者体内存在着补体系统的过度激活。补体系统是一种免疫和炎症平衡的调节系统，过度激活将导致大量炎性因子的释放和聚集，从而导致机体炎症损伤[12]。机体在慢性低度炎症及免疫功能紊乱相互作用的情况下，可能会通过相关途径诱导PCOS患者出现IR、HA及肥胖[6,7]。

补体级联反应有三条途径，分别为经典途径、凝集素途径及旁路途径。进一步分析两个数据库中均富集的补体级联反应信号通路，唯一共同注释的差异表达蛋白为MBL,MBL是凝集素途径中的重要参与蛋白。MBL是一种血浆蛋白，其与碳水化合物结构结合后，再与MBL相关的丝氨酸蛋白酶(MBL-associatedserineprotease,MASP-1)、MASP-2形成MBL复合物并同时活化MASP,MASP可水解C4和C2,进一步形成C3转化酶[14],从而引发补体的一系列级联反应。本研究中MBL为上调差异表达蛋白，说明PCOS组患者体内MBL含量是升高的，提示PCOS组可能因高MBL启动凝集素途径过度激活补体级联通路。

目前MBL在PCOS患者中的研究尚未见报道，但多项研究表明MBL激活的凝集素途径与各种自身免疫性疾病、感染性疾病的病理生理过程密切相关，包括抗凝脂综合征[15]、风湿性心脏病[16]、COVID-19患者的肺损伤等[17],高MBL可能增加炎症损伤的风险[18]。既往的一项动物实验研究表明，用针对MBL的抑制性单克隆抗体阻断补体激活的MBL途径，可以通过减少中性粒细胞浸润和衰减原炎基因激活来保护心脏免受缺血再灌注损伤[19]。

最近有学者总结认为MBL受体介导的效应子功能除了补体系统激活外，还能直接调理异噬作用、MBL依赖性细胞介导的细胞毒性、细胞凋亡、促炎细胞因子的释放和活性氧的产生[20]。但PCOS患者MBL水平增高的具体机制以及MBL在PCOS患者体内引起炎症的具体靶器官和组织尚不明确，需进一步研究。

综上所述，PCOS患者体内可能存在补体系统的过度激活，差异蛋白MBL可能是其中的关键致病因子。

参考文献:

[1]袁莹莹,赵君利.多蠹卵巢综合征流行病学特点[J].中国实用妇科与产科杂志,2019,35(3):261-264.

[4]中华医学会妇产科学分会内分泌学组及指南专家组.多蠹卵巢综合征中国诊疗指南[J].中华妇产科杂志,2018,53(1);2-6.

[5]梁杨焕,张炯,谢芹.多囊卵巢综合征不孕患者性激素与外周血Th1Th2的关系[J].实用预防医学,2018,25(10)1224-1226.

[7]李子涵,张宁,李菲,等.多囊卵巢综合征的免疫学发病机制研究进展[J].山东医药,2018,58(19):101-104.

[10]宁龙贵,俞静华,单国栋,等.蛋白质组学技术筛选缺血性结肠炎与溃疡性结肠炎鉴别诊断的血清学标志物[J].中华消化杂志,2019,39(12):840-845.

[11]寇丽辉,侯丽辉,牛静云,等.蛋白质组学在多蠹卵巢综合征中的应用进展[J].医学研究杂志,2018,47(9):183-185,164.

[12]谢丽珍.基于定量蛋白质组学技术的肥胖多囊卵巢综合征患者血清差异蛋白生物信息学分析[D].广州:广州医科大学,2018:1-63.

文章来源：邹颖,马丹,穆仪冰,方超英.血清TMT标记定量蛋白质组学对多囊卵巢综合征病因研究[J].实用预防医学,2021,28(11):1311-1315.