无创产前检测(non-invasive prenatal testing, NIPT)是利用高通量基因测序技术对孕妇外周血游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)进行深度测序，从而获取胎儿染色体信息的方法。NIPT可有效避免穿刺引起的流产、宫内感染等风险，同时具有无创、安全、准确等优势。目前国内外数据表明，NIPT针对3种常染色体三体即21-三体(trisomies 21,T21)、18-三体(trisomies 18,T18)和13-三体(trisomies 13,T13)的疾病灵敏度分别为99.5%、93.1%、92.7%,特异度达99.9%以上[1,2],这并不意味NIPT高风险单个个体的患病风险超过99%。阳性预测值(positive predictive value, PPV)能更好地反映NIPT高风险人群生育染色体非整倍体胎儿的风险。这与检测灵敏度、特异度以及疾病患病率等均相关，但目前研究较少[3,4,5]。NIPT检测后高风险人群的遗传咨询在临床诊疗中至关重要，合理解读NIPT检测结果可降低孕妇焦虑情绪。本研究旨在分析台州地区NIPT高风险人群特征，探讨NIPT对染色体非整倍体疾病的检出能力及其影响因素，为NIPT高风险人群产前遗传咨询提供依据。

1、对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月—2021年12月在浙江省台州医院产前诊断中心行NIPT检测结果为T21、T18和T13高风险的孕妇284例进行回顾性分析，建议NIPT高风险孕妇做侵入性产前诊断确诊，并对所有病例进行跟踪随访。孕妇均已签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会批准(K20200804)。NIPT检测孕妇就诊指征分别为：①血清学筛查临界风险(1/1 000≤21-三体风险值<1/270,1/1 000≤ 18-三体风险值<1/350);②错过其他检查最佳时间(孕周 ≥ 26周);③高龄(预产期年龄≥35周岁);④辅助生殖；⑤双胎；⑥血清学筛查高风险(21-三体风险值≥1/270,18-三体风险值≥1/350);⑦无上述指征但是要求行NIPT检测的孕妇。

1.2 方法

1.2.1 NIPT检测

用Streck Cell-Free DNA BCT采血管采集孕周12周以上孕妇外周血10 ml, 1 600 g离心10 min取上清液。用胎儿染色体非整倍体(T13、T18、T21)检测试剂盒(东莞博奥木华基因科技有限公司)提取血浆cffDNA、文库制备、经BioelectronSeq 4000测序仪高通量基因组测序，获得cffDNA片段数量和碱基排列，测序深度为0.1×～0.2×。参考基因组GRCH37/gh19,用生物信息学方法消除GC偏倚，计算每条染色体的唯一匹配Reads数(unique reads)。NIPT检测是通过计算孕妇各条染色体相对于参考人群各条染色体unique reads的差异来判断检测样品中所含的染色体数量异常程度来判断胎儿染色体数量是否异常。Z值指待测染色体比例(%chrN)相对参考人群的变异系数，符合标准正态分布，是NIPT检测染色体非整倍体的阈值。通常使用3σ水平(Z=3)作为风险阈值：-3<Z<3则判定为染色体非整倍体低风险；Z≥3或Z≤-3则判定为染色体非整倍体高风险，其中Z≥3是染色体多倍体高风险。

%chrN=染色体N上unique reads的总数/(全部常染色体N上unique reads的总数)×100%(N=1,2,3…22,X,Y)

Z-score=(样本的%chrN-参考样本的%chrN的平均值)/(参考样本的%chrN的标准差)(N=1,2,3…22,X,Y)

1.2.2 侵入性产前诊断

18～22+6周的孕妇在超声指引定位下行羊膜腔穿刺术，抽取30 ml羊水完成染色体核型分析和CNV-seq检测。20 ml羊水细胞经过培养增殖，加秋水仙素，经低渗固定处理制成标本片，通过G显带和吉姆萨染色获得较好分裂相，在显微镜下计数20个中期细胞，分析其中5个，按《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)2016》描述核型。如遇嵌合体，需计数50个细胞。10 ml羊水经4 ℃保存送至东莞博奥木华基因科技有限公司行CNV-seq检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件分析数据。使用阳性预测值作为NIPT对21、18、13-三体综合征检出能力评价指标，通过logistic回归分析探讨阳性预测值与Z值、年龄、辅助生殖及血清学筛查的关系。计数资料数据以[例(%)]形式表示，比较采用多组率的χ2检验或Fisher精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。组间阳性预测值采用多重比较α分割方法，以“P=0.05/比较次数”作为检验水准。

2、结 果

2.1 NIPT高风险孕妇指征分布

2017年1月—2021年12月期间在浙江省台州医院行NIPT检测的高风险孕妇共284例，其中21-三体综合征169例、18-三体综合征65例，13-三体综合征50例。高风险孕妇就诊行NIPT检测以高龄为最常见指征，构成比占44.01%(125/284),其次是血清学筛查临界风险16.55%(47/284)、自愿要求行NIPT检测16.90%(48/284)和血清学筛查高风险13.73%(39/284),辅助生殖4.93%(14/284)、双胎1.76%(5/284)和错过其他检查时间2.11%(6/284)相对比例较少。

2.2 NIPT高风险孕妇确诊情况及阳性预测值

NIPT高风险孕妇21、18、13-三体综合征确诊情况及阳性预测值见表1。确诊嵌合体或染色体微重复的胎儿临床意义不明，本研究将其纳入真阳性部分。21、18、13-三体综合征的阳性预测值值分别为79.74%(126/158)、61.67%(37/60)和19.57%(9/46)。另外19例NIPT高风险孕妇拒绝介入性诊断直接选择引产可能会导致部分染色体正常胎儿流失。5例NIPT高风险孕妇拒绝进一步检查仍继续妊娠，出生后家属自述新生儿表型正常，尚不能排除染色体异常可能。

表1 单胎NIPT高风险孕妇确诊情况及阳性预测值(例)

2.3 NIPT检测对单胎21、18、13-三体综合征检出能力影响因素分析

阳性预测值与NIPT结果和疾病人群患病率等均相关，反映NIPT高风险人群孕育染色体非整倍体胎儿的风险。Z值作为判断阈值直接影响NIPT结果，高龄、辅助生殖或血清学筛查高风险作为产前高危人群可能影响疾病患病率。本研究纳入Z值、年龄、辅助生殖、血清学筛查进行多因素logistic回归分析，结果发现：Z值对21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征疾病检出的阳性预测值均具有统计学意义(T21: OR=0.66,95% CI:0.56～0.78,P<0.05; T18: OR=0.54,95% CI:0.38～0.77,P<0.05; T13: OR=0.90,95% CI:0.81～1.00,P<0.05);年龄对21-三体综合征、18-三体综合征疾病检出的阳性预测值具有一定影响(T21: OR=0.91,95% CI:0.81～1.01,P=0.074; T18: OR=0.73,95% CI:0.54～0.99,P<0.05)。NIPT检测阳性预测值影响因素的logistic回归分析具体见表2。 

表2 NIPT检测阳性预测值影响因素的logistic回归分析  

本研究除去嵌合体或染色体微重复病例，将确诊的NIPT高风险单胎孕妇根据Z值大小分成3组，分析NIPT Z值对21、18、13-三体综合征检出能力的影响。结果显示Z值增大，NIPT检测21、18-三体综合征的阳性预测值值越大。χ2检验或Fisher精确概率法分析发现，NIPT检测21、18、13-三体综合征Z值3个分组的阳性预测值均存在统计学差异(T21:χ2=88.94,P<0.001; T18: χ2=34.89,P<0.001; T13: Fisher精确概率法，P<0.05)。21-三体综合征的Z≥10、5≤Z<10和3≤Z<5两两比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。18-三体综合征的Z≥10或5≤Z<10和3≤Z<5相比，差异均有统计学意义(P<0.05),Z≥10和5≤Z<10相比，差异无统计学意义(P>0.017)。13-三体综合征的Z≥10与5≤Z<10或3≤Z<5相比，差异有统计学意义(P<0.017),5≤Z<10与3≤Z<5间差异无统计学意义(P>0.017)。NIPT检测Z值对单胎21、18、13-三体综合征阳性预测值影响见表3。

表3 NIPT检测Z值对单胎21、18、13-三体综合征阳性预测值影响

2.4 胎儿嵌合体/染色体拷贝数变异对NIPT检出能力的影响

264例NIPT高风险经羊水穿刺确诊，其中胎儿染色体嵌合体占1.89%(5/264),染色体拷贝数变异占1.89%(5/264)。5例染色体嵌合体均是21-三体综合征高风险孕妇召回进行羊水穿刺而发现，嵌合体在T21高风险中占比为3.16%(5/158)。其中病例1～4的Z值均<10,胎儿浓度均>8%,且21-三体嵌合比例较低，在足够胎儿浓度情况下胎儿嵌合可能由于异常染色体的比例不同导致NIPT检测Z值降低，不排除Z值在正常范围且临床症状不明显的胎儿嵌合体没有得到确诊而漏检。见表4。

检出胎儿染色体拷贝数变异包括1例21号染色体微重复，2例18号染色体微重复和2例13号染色体微重复。病例6、9、10染色体微重复片段<5 Mb、Z值<10,另外病例7、8染色体微重复片段>5 Mb、Z值>10,在足够胎儿浓度情况下胎儿染色体微重复可能由于重复片段大小不同导致NIPT检测Z值高于正常，而被检出为NIPT高风险。

表4 胎儿嵌合体/染色体微重复对NIPT检出能力的影响

3、讨 论

目前研究对NIPT检测21、18、13-三体综合征的筛查高灵敏度和特异度一致认同[1,2],不同人群发病率差异导致NIPT检出效率有所不同[6]。阳性预测值用于产前遗传咨询能更好地反映NIPT高风险人群生育染色体非整倍体胎儿的风险。本研究结果显示，NIPT检测21、18、13-三体综合征的阳性预测值分别为79.74%、61.67%和19.57%,与文献报道趋势一致[7,8]。NIPT高风险孕妇拒绝介入性诊断，直接选择引产可能会导致部分染色体正常胎儿流失，特别是13-三体综合征高风险。产前遗传咨询中可根据不同染色体阳性预测值合理解释NIPT结果，降低孕妇拿到NIPT高风险报告时的焦虑情绪。

阳性预测值与NIPT检测结果及发病率均相关，后验风险准则更适用于判断个体患染色体非整倍体的风险[9]。国家卫生健康委员会相关文件指出，高龄、血清学筛查高风险及辅助生殖等高危妊娠是NIPT检测慎用人群。孕妇高龄会增加胎儿染色体非整倍体异常的患病风险已有较多报道[10],本研究高风险孕妇就诊行NIPT检测以高龄为最常见指征，但年龄仅对18-三体综合征的阳性预测值有统计学意义，主要考虑样本量偏少及就诊NIPT人群分布影响。血清学筛查风险和辅助生殖对NIPT检测的阳性预测值均无统计学意义，不排除疾病患病率低及样本量不足导致其影响无法检出。有研究[3,4,5]表明，NIPT检测的判断阈值Z值与阳性预测值相关，但仍需大量临床数据支持。Sikkema-Raddatz等[6]研究认为，Z值>5会提高NIPT高风险孕妇孕育染色体异常胎儿的真阳性率，但不同染色体Z值的变化相对应的不同疾病检出能力不同。赵干业等[11]研究结果显示，Z值大小与21、18-三体综合征阳性预测值呈正相关，但局限于样本量未对13-三体综合征进行分析。本研究通过多因素logistic回归分析发现，Z值对21、18、13-三体综合征疾病检出的阳性预测值均有统计学意义(P<0.05),是阳性预测值的独立影响因素。Z值增大会提高NIPT检测21、18-三体综合征的阳性预测值。本研究13-三体综合征确诊病例少及检测灵敏度相对较低，Z值>10会显著提高13-三体综合征阳性预测值。3≤Z<5时21、18、13-三体阳性预测值仅为11.11%、10.00%和5.56%,这主要受局限性胎盘嵌合[12]以及分析所用参考人群、胎儿cffDNA浓度、测序深度等实验因素影响。母体因素包括嵌合体、肿瘤、母亲体质量偏重等[13,14]会影响孕妇外周血cffDNA分布和含量而影响NIPT检测结果。Z>10时21、18-三体综合征的阳性预测值超过95%,假阳性主要考虑胎盘嵌合的可能。

染色体嵌合体可能会造成胎儿部分器官结构或功能的异常，在产前诊断中常有发现。胎儿存在嵌合体会对NIPT结果产生影响[15],NIPT对于嵌合体的检出情况少有报告。本研究发现4例胎儿存在染色体嵌合情况，NIPT检测Z值均不高，这可能与胎儿嵌合比例、胎儿浓度、双胎等有关。胎儿染色体微重复由于局部染色体数量增加导致Z值异常升高被检出，Z值大小与染色体微重复片段长度和拷贝数等相关。NIPT对胎儿染色体嵌合体和微重复有一定的检出能力，Z值在临界范围或小于10的情况下应警惕胎儿染色体嵌合情况。胎盘嵌合体在足月胎盘中的发生率约4.8%,NIPT检测的孕妇外周血胎儿cffDNA主要来源于胎盘滋养层细胞，因此NIPT只是一种特异度相对高的产前筛查，不能代替产前诊断。NIPT高风险孕妇需引起高度重视，进一步行羊水或脐血穿刺进行产前诊断确诊。

综上所述，不同染色体NIPT检测的阳性预测值值有所差异，Z值与21、18、13-三体综合征疾病检出的阳性预测值相关，Z值增大提高NIPT检测的阳性预测值。NIPT对胎儿嵌合体和染色体拷贝数变异有一定检出能力。临床产前咨询中可以结合Z值大小合理解读NIPT检测结果，降低孕妇拿到NIPT高风险报告时的焦虑情绪。但值得注意的是无论Z值大小，NIPT高风险孕妇需行有创性产前诊断明确诊断。

参考文献:

[11]赵干业,代鹏,胡爽,等.无创产前检测胎儿染色体非整倍体阳性预测值的影响因素分析[J].中华医学杂志,2022,102(31):2452-2457.

基金资助:浙江省医药卫生科技计划项目(2021KY1196);台州市科技计划项目(20ywa13);恩泽医疗中心(集团)科学研究基金(17EZB4);

文章来源:潘飞燕,狄星宏,许惠惠等.台州地区284例无创产前检测高风险孕妇影响因素分析[J].中国妇幼保健,2023,38(23):4629-4633.