宫颈癌(cervical cancer, CC)是女性常见的恶性肿瘤之一[1]。持续性人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是导致宫颈癌的主要原因。2018年全球有约57万宫颈癌新发病例和31.1万死亡病例，其中中国宫颈癌死亡病例约占全球的六分之一[2]。虽然宫颈癌根治性手术结合辅助性放化疗已经极大的改善了患者的生存率[3,4],但是宫颈癌晚期患者5年生存率仍较低[5]。阐明肿瘤发生发展的遗传特征，有助于发现早期宫颈癌相关分子靶点。

基因突变是机体受环境或遗传因素的影响而发生的基因DNA序列上的碱基替换、插入和缺失等的改变，从而引起肿瘤性疾病的发生和(或)促进其发展。WU等[6]通过GEO数据库对21例肿瘤样本及10例宫颈正常样本进行生物信息学分析显示，TSPO、CCND1和FOS等是宫颈癌中的关键基因，差异表达基因在细胞周期、DNA复制和p53等信号通路中均显著富集。QIU等[7]通过对32例宫颈癌患者的组织样本进行靶向测序，发现患者可能受益于PARP抑制剂。宫颈癌是近年来“两癌筛查”项目的重点筛查对象，为响应WHO消灭宫颈癌的号召，检测体系突变基因对本疾病的早期诊断、治疗和预后等方面可能产生积极地影响。因此，本研究将收集113例宫颈癌患者癌及癌旁组织进行二代测序，并对突变基因进行生物信息学分析，探讨突变基因与临床病理特征之间的关系，为宫颈癌早诊早治及进一步阐明宫颈癌的突变特征提供理论依据。

1、资料和方法

1.1 临床样本收集

回顾性收集2012年12月至2019年04月间贵州医科大学附属医院病理确诊为原发性宫颈癌的113例病例，患者年龄28～73岁，中位年龄49岁。纳入标准：(1)病理明确诊断为原发性宫颈癌，同时具有癌和癌旁组织宫颈癌根治术后标本；(2)初次行宫颈癌根治术，术前不施行放射治疗；(3)具有完整的病历信息。排除标准：(1)病理明确诊断为非原发性宫颈癌；(2)病历信息不完整。本研究获得贵州医科大学附属医院医学伦理委员会批准，所有患者和/或家属均知情同意(伦理号：2021652)。

1.2 基因组DNA提取及上机测序

利用MagPure FFPE DNA LQ Kit试剂盒(美基，中国)分别从福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的癌组织和癌旁组织中提取基因组DNA。分别使用 Qubit(QubitTM dsDNA HS Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, USA)检测DNA浓度和Nanodrop(Thermo Fisher Scientific, USA)检测DNA纯度，文库浓度均>25 ng/μL。选用7N非甲基化建库试剂盒(北京优乐复生公司，中国北京)进行文库制备，运用Human Cot-1 DNA®(Invitrogen, USA)试剂盒和Hybridization and Wash Kit-xGen Lockdown Reagents(IDT,USA)试剂盒分别进行文库封闭和杂交捕获；应用DynabeadsTM M-270 Streptavidin(Invitrogen, USA)进行链霉亲和素标记磁珠捕获目标基因外显子；采用KAPA Biosystems(Kapa Biosystems, USA)进行PCR扩增富集目标基因；通过Illumina(Illumina, USA)平台运用PE150对基因组DNA目标区域进行测序。

1.3 测序数据处理

对Raw reads进行精细过滤，去除带接头的、低质量的Reads; 有效测序数据通过BWA比对到参考基因组(GRCh37/hg19),得到BAM格式的最初的比对结果，用Picard标记重复Reads(MarkDup);用SAMtools对比对结果进行排序，以癌旁组织作为正常对照，过滤胚系突变基因。利用生物信息学方法将测序结果对比参考基因组(GRCh37/hg19)数据库和refseq数据库进行分析。

1.4 基因突变位点筛选要求和分类原则

以COSMIC( https: //cancer.sanger.ac.uk/cosmic/)突变数据库注释结果为依据，联合美国医学遗 传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)和分子病理学协会(Association for Molecular Pathology, AMP)[8]的联合共识建议及《遗传变异分类标准与指南》[9]的分类方案对筛选后的体系突变结果进行分类为致病、疑似致病、意义不明确、良性和可能良性等5种类型。本研究根据测序结果将胚系突变结果设置为致病性突变组(致病)和意义不明确突变组。

1.5 生物信息学分析及统计分析

使用R语言(R4.13)的maftools包对突变信息进行汇总分析，应用oncoplot绘制体系突变瀑布图；采用somaticInteractions函数检测协同或互斥的基因集，GO富集和KEGG 富集分析使用DAVID 数据库。潜在靶基因参考ONCOKBTM数据库。应用SPSS 25.0进行统计学分析，组间比较使用Pearsonχ2检验或连续性修正的χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 宫颈癌患者体细胞突变谱

在本研究中，113例患者经NGS检出324个体系突变基因及相应的3 677个突变位点，前十位基因(TOP10)分别是PIK3CA、NOTCH1、ERBB2、EGFR、FBXW7、KMT2D、ARID1A、FAT1、RUNX1和KMT2C;取TOP20高频突变的基因展示，并列出所有变异分类，包括2 564个错义突变、267个无义突变、251个5' 非编码区突变、187个沉默突变、146个内含子突变、125个3' 非编码区突变、83个非移码缺失突变、34个移码缺失突变、20个移码插入突变等共计9种变异类型，其中错义突变占所有变异类型的69.73%(2 564/3 677),见图1。

2.2 113例宫颈癌患者TOP20体系突变基因协同和互斥分析

对TOP20基因的互作关系进行分析，绝大部分基因是共同发生(协同性),其中PIK3CA与KRAS存在高度协同性(P<0.05),见图2。

2.3 113例宫颈癌患者突变基因GO和KEGG通路的富集分析

将所有突变基因进行GO生物功能富集与KEGG通路富集分析；GO生物功能富集分析显示，患者突变基因在调节细胞增殖、凋亡等功能中富集；KEGG通路富集分析显示，宫颈癌患者突变基因在PI3K-Akt、MAPK等信号通路中显著富集。以P<0.05筛选得到相关的10条通路进行可视化展示，见图3。

图1 排名前20的体系突变基因及变异类型热图

图2 排名前20的体系突变基因相互关系

2.4 113例宫颈癌患者基因体系致病性突变

进一步利用生物信息学方法对测序结果分析发现，324个体系突变基因及相应的3 677个突变位点中发现166个为致病性突变位点，占4.51%(166/3 677),该166个致病性突变位点发生在87例CC患者53个相对应的体系突变基因中，其中突变频率较高的基因包括PIK3CA、FBXW7、PTEN、TP53、ARID1A、ERBB2和KRAS,见图4。将166个致病突变位点在数据比较丰富的COSMIC和ONCOKBTM数据库中检索，依据两个数据库的分类 方式进行联合判读，新发 现ARID1A、EP300和SMARCA4等32个基因相应的47个突变位点未收录其中，新发现的致病性突变的基因及其位点发生在常染色体上，其中主要以5、19和1号染色体上突变较为突出。进一步将上述47个位点在基因组聚合数据库(genome aggregation database, GnomAD)中检索，结果显示变异位点上突变碱基的等位基因频率(GnomAD_AF)和所有亚洲人群中变异位点上突变碱基的等位基因频率(GnomAD_AF_EAS)均未检出或检出率均小于0.001。

图3 113例宫颈癌患者突变基因GO和KEGG富集图

2.5 ONCOKBTM数据库分析潜在治疗靶基因

参考ONCOKBTM数据库分析了已知的治疗靶基因，在53个致病基因中筛选出包括PIK3CA、PTEN、ATM、ERBB2、BRCA2、NF1和KRAS等17个靶基因，共计104个位点，基因突变相关的靶向药物包括Alpelisib+Fulvestrant、Trastuzumab、GSK2636771、AZD5363和Olaparib等，见表1;相关药物已用于乳腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等肿瘤的研究，部分药物已用于临床，53.98%(61/113)的宫颈癌患者具有相关的突变位点。

2.6 宫颈癌患者基因体系致病性突变与临床病理特征的关系

纳入研究的113例宫颈癌患者中87例患者检出发生致病性突变(76.99%)。致病性突变在HPV感染和肿瘤浸润深度中差异具有统计学意义(P<0.05),在年龄、绝经状态、病理分化程度、淋巴结转移、脉管侵犯和FIGO分期等差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

图4 宫颈癌患者基因胚系致病性突变热图

表1 体系致病突变基因及相关靶向药物

3、讨论

宫颈癌在女性生殖系统恶性肿瘤中排名第二位[10],其与HPV病毒感染有关[11],但HPV感染并非宫颈癌相关的唯一因素，其进展与肿瘤相关基因突变关系密切[12],部分地区由于缺乏有效筛查，宫颈癌发病率和死亡率仍较高[13]。OJESINA等[14]首次报道了79 例宫颈鳞癌患者MAPK1、HLA-B、EP300、FBXW7、NFE2L2、TP53和ERBB2等基因未知的体细胞突变。癌症基因图谱(the cancer genome atlas, TCGA)计划[15]报道在228例宫颈癌患者中新发现SHKBP1、ERBB3、CASP8、HLA-A和TGFBR2等显著突变基因，突变基因在宫颈癌的发展进程中发挥重要作用；积极寻找突变显著的致病基因及其特点，对宫颈癌制定有效防治措施至关重要。

机体发生体细胞突变被认为与肿瘤发生息息相关，突变发生后，通过筛选适应环境后在机体内累积，部分突变发挥“驱动突变”的角色影响肿瘤的发生发展[16]。本研究对113例宫颈癌患者基因突变及临床病理特征进行探讨，结果显示，113例患者检出324个体系突变基因及相应的3 677个突变位点，突变频率排名靠前的基因分别是PIK3CA、NOTCH1、ERBB2、EGFR、FBXW7、KMT2D、ARID1A、FAT1、RUNX1和KMT2C等，突变基因总共出现错义突变、无义突变、5' 非编码区突变、沉默突变、内含子突变、3' 非编码区突变、非移码缺失突变、移码缺失突变、移码插入突变等共计9种变异类型，发生变异的种类各有差异，其中错义突变是最常见的变异类型；基因突变变异类型较多，揭示突变发生的多样性；既往研究表明，错义突变在宫颈癌的发生、进展及治疗中有重要意义[12,17];参照致癌多阶段研究理论，基因突变与肿瘤密切相关，基因随年龄增长受到多种因素的相互影响，以促进基因突变的数量不断积累，从而导致不同阶段肿瘤的发生和(或)发展[16]。本研究结果显示，TOP20基因中，绝大部分基因突变是共同发生、相互间存在协同性；突变基因GO生物功能富集分析显示，宫颈癌患者突变基因在调节细胞增殖和凋亡功能中富集，并在PI3K-Akt、MAPK等信号通路中显著富集。PI3K-Akt是肿瘤形成中最常见的通路[18],提示突变基因可能通过PI3K-Akt、MAPK等信号通路参与肿瘤细胞的增殖、参与细胞周期的调控，可能成为靶向治疗的候选基因。

表2 113例宫颈癌患者体系基因致病性突变与不同临床病理特征的关系n(%)

基因突变位点的碱基改变可能会引起其编码的蛋白质结构的改变，从而造成肿瘤的发生[19],不同基因突变位点在癌症发生发展中作用各有差异[12,20]。对本研究数据深度挖掘发现，共有166个致病性突变位点，致病性突变与HPV感染及浸润深度相关，既往研究显示，HPV整合位点的基因表达水平显著增高[14],提示检测患者致病性突变可能对宫颈癌早期诊断及预测有一定意义。进一步将致病性突变基因在两大比较全面的COSMIC和ONCOKBTM数据库中检索和比对综合分析，新发现ARID1A、EP300和SMARCA4等32个基因相应的47个突变位点未收录其中，使用GnomAD数据库中检索，结果显示变异位点上突变碱基等位基因频率均未检出或检出率均小于0.001;本课题组前期研究显示[21],宫颈癌胚系突变基因主要发生于常染色体，本实验结果新发现的体系致病基因中，除外KDM6A基因突变也多分布于常染色体，以1号、5号和19号常染色体为主，这些新发现的突变可能参与宫颈癌发生和发展的致病机制，将是宫颈癌未来需要关注的突变位点。利用ONCOKBTM数据库对致病性基因进一步分析，确定了53个致病基因中包括PIK3CA、PTEN、ATM、ERBB2、BRCA2、NF1和KRAS等17个靶基因，共计104个位点基因为宫颈癌潜在靶点，可能受益于Alpelisib+Fulvestrant、Niraparib和Olaparib等[7,22,23]多种靶向药，提示靶向药物治疗宫颈癌可能具有一定临床应用价值，未来有望成为宫颈癌靶向治疗需要关注的突变位点。

综上所述，本研究从113例宫颈癌中检测出87例患者致病性体系突变基因，初步阐述了基因的突变特点与临床病理特征之间的关系，今后将进一步深入探究本研究发现的53个已知和未知基因的致病性突变信息及其参与调控的信号通路，为后续宫颈癌的机制研究、早期预防、精确诊断和靶向治疗提供一定理论依据。

参考文献:

[9]王秋菊,沈亦平,邬玲仟,等.遗传变异分类标准与指南[J].中国科学:生命科学,2017,47(06):668-688.

[10]何冬玲,韦广月,王纯,等.2018-2020年贵阳地区女性宫颈癌HPV､TCT及DNA倍体联合筛查结果分析[J].肿瘤,2021,41(02):121-130.

[21]姜德文,李彬,何冬玲,等.子宫颈鳞状细胞癌基因胚系突变特点及与临床特征的关系[J].实用妇产科杂志,2023,39(06):454-459.

基金资助:国家自然科学基金(编号:81960572); 贵州省科技厅科技支撑计划资助项目[编号:黔科合支撑(2019)2791]; 贵州省贵阳市科技计划资助项目[编号:筑科合同(2019)9-1-16];

文章来源:李彬,何冬玲,姜德文,等.基于二代测序的宫颈癌突变基因分布情况及相关临床特征分析[J].现代肿瘤医学,2024,32(14):2601-2606.