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C-X-C趋化因子受体4拮抗剂延缓豚鼠关节软骨的退变

2021-12-06 122 上传者：管理员

摘要：背景:近年来研究表明基质细胞衍生因子1/C-X-C趋化因子受体4信号通路在骨关节炎的发生发展中起重要作用。目的:探讨不同C-X-C趋化因子受体4拮抗剂在体内对关节软骨退变的作用。方法:选取96只6月龄雄性Hartley豚鼠随机分成4组,TN14003治疗组、T140治疗组、AMD3100治疗组、空白对照组,每组24只。除空白对照组不做任何处理外,其余治疗组均使用Alzet微量泵直接植入并固定于豚鼠背部皮下,每天以180mg/L的质量浓度泵入TN14003、T140、AMD3100药物,干预12周后,取膝关节软骨行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色、改良Mankin组织学评分;免疫组织化学检测白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平。结果与结论:(1)苏木精-伊红染色、番红-固绿染色显示:TN14003治疗组显著延缓了软骨退变程度,Mankin评分最高;T140治疗组次之,AMD3100治疗组较差,空白对照组最差;各组Mankin评分差异有显著性意义(P<0.05);(2)免疫组织化学染色分析显示:各治疗组关节软骨组织中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α阳性表达均低于空白对照组,其中以TN14003治疗组最少(P<0.05);(3)结果表明,3种C-X-C趋化因子受体4拮抗剂均可通过阻断基质细胞衍生因子1/C-X-C趋化因子受体4信号通路,降低白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平,延缓软骨退变,其中TN14003治疗组效果最优。

关键词：
CXCR4
CXCR4受体拮抗剂
SDF-1
信号通路
豚鼠
软骨退变
骨关节炎
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骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，其典型的病变特征是关节软骨完整性的退变和关节间隙变窄，是全世界范围内导致残疾的主要原因[1,2]。越来越多的研究关注软骨细胞的表达，软骨细胞被认为是生物力学因素的靶点，这些细胞的异常功能改变，从而引起骨性关节炎的生理改变[2]。

前期研究表明基质细胞衍生因子1(stromalcell-derivedfactor-1,SDF-1)是与炎症相关的趋化因子，通过与7种跨膜G蛋白偶联受体C-X-C趋化因子受体4(C-X-Cchemokinereceptortype4,CXCR4)结合[3,4]。SDF-1在关节滑膜中表达显著增加，而其受体CXCR4在关节软骨细胞和软骨下骨髓基质细胞中的表达显著升高；研究发现SDF-1/CXCR4信号通路可能与骨关节炎的发生密切相关，通过诱导软骨细胞外基质释放基质金属蛋白酶，从而加剧骨关节炎的疾病进展[5,6,7]。CXCR4受体抑制剂TN14003[8]、T140[9]、AMD3100可以干预SDF-1/CXCR4信号通路[10,11,12,13]，并在体外实验中取得了良好的效果，但各种拮抗剂药物抑制SDF-1/CXCR4信号通路对体内骨关节炎软骨退变的优劣性仍不清楚。因此，该研究旨在系统评价不同CXCR4特异性受体拮抗剂对骨关节炎的治疗效果，对未来研究骨关节炎治疗的最佳候选药物提供实验依据。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验。

1.2 时间及地点

实验于2017年2月至2018年2月在昆明医科大学基础医学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

96只6月龄雄性Hartley豚鼠，体质量(400±50)g，购于昆明医科大学实验动物学部，许可证编号：SCXK(滇)K2020-0006。所有动物饲养于昆明医科大学动物实验中心，该实验经昆明医科大学动物实验伦理委员会批准，批准文号为kmmu2021420。

1.3.2 实验试剂与仪器

病理切片机(RM2135,Leica公司，德国)；普通光镜(E200,NIKON公司，日本)；苏木精-伊红染色、番红-固绿染色试剂盒(广州展晨公司，中国)；石蜡(上海华灵康复器械厂，中国)；显微摄影系统(DM4000B,Leica公司，德国)；Alzet微量泵(上海普迈生物科技有限公司，中国)；T140冻干粉、TN14003冻干粉、AMD3100冻干粉(北京中科亚光公司，中国)；兔抗豚鼠白细胞介素1抗体、豚鼠抗肿瘤坏死因子α多克隆抗体(Abcom公司，英国)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立实验动物模型

96只6月龄雄性Hartley豚鼠随机分成4组：TN14003治疗组、T140治疗组、AMD3100治疗组、空白对照组，每组24只。除空白对照组不做任何处理外，其余治疗组均使用Alzet微量泵直接植入并固定于豚鼠背部皮下，每天以180mg/L的质量浓度泵入TN14003、T140、AMD3100药物，每天泵入1mL，共给药治疗12周，见图1。

1.4.2 实验动物取材与制片

治疗12周后，采用戊巴比妥钠腹腔注射法处死全部实验动物，取双膝关节软骨组织，裁剪为大小约1mm×3mm×3mm的组织块，多聚甲醛溶液中固定24h，梯度乙醇脱水，对组织块进行透明和浸蜡包埋、塑形和切片；切片后置于清洁载玻片上进行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色和封固，观察组织内部的软骨细胞改变。

1.4.3 改良Mankin组织学评分

采用改良Mankin组织学评分对苏木精-伊红染色、番红-固绿染色切片的骨关节炎软骨病变严重程度进行组织病理学分级。改良Mankin评分分值与骨关节炎严重程度的组织病理学分级直接相关，分值越高，表示软骨退变程度越严重。0分代表软骨正常，14分代表最严重的软骨病变。

1.4.4 免疫组织化学染色

治疗12周后，将1.4.2中动物取材获得的软骨组织切成20μm厚切片，置于PBS漂洗；在体积分数为3%过氧化氢溶液中孵育30min，再次PBS漂洗；体积分数为5%羊血清37℃孵育30min，加入兔抗豚鼠白细胞介素1抗体、豚鼠抗肿瘤坏死因子α多克隆抗体4℃孵育过夜，二氨基联苯胺显色，乙醇脱水，二甲苯透明，封固。每张切片随机观察多个视野进行图像分析，统计分析白细胞介素1和肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数。

1.5 主要观察指标

(1)苏木精-伊红染色、番红-固绿染色观察软骨细胞的变性和分布情况；(2)Mankin组织学评分标准评估软骨退化情况；(3)免疫组织化学染色观察Hartley豚鼠膝关节软骨组织中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的阳性细胞表达率。

1.6 统计学分析

采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析，所有数据均用表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05,P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

选取96只6月龄雄性Hartley豚鼠，实验过程中无死亡，全部纳入结果分析。实验过程中观察TN14003治疗组动物行走无跛行和后肢伸展情况良好，T140治疗组次之，AMD3100治疗组较差，空白对照组最差。

2.2 苏木精-伊红染色结果

TN14003治疗组仅有轻微的骨关节炎改变，关节软骨较光滑，有较致密的软骨细胞外基质，软骨细胞分布密集，关节软骨表面无明显损伤、结构断裂，无软骨水肿、退变的病理改变，空骨陷窝较少，无纤维化；T140治疗组及AMD3100治疗组软骨损伤程度均较TN14003治疗组稍严重，较空白对照组明显减轻；空白对照组可见有严重的骨关节炎软骨损伤，软骨面明显变薄，表层软骨细胞脱落、排列紊乱无序，细胞核染色不均匀，细胞数量少，含少量的松质骨，空骨陷窝较多，可见明显纤维化，见图2。

2.3 番红-固绿染色结果

TN14003治疗组关节软骨厚度显著增加，软骨表面无明显破坏，软骨细胞无明显减少，蛋白多糖丢失减少，软骨损伤改善；T140治疗组及AMD3100治疗组骨关节炎软骨损伤程度均较TN14003治疗组稍加重，较空白对照组明显减轻；空白对照组软骨平面和基质结构不平整，细胞核染色不均匀，染色较淡，蛋白多糖含量明显降低，细胞排列无序。结果可见，TN14003治疗组仅有轻微的骨关节炎软骨退变，空白对照组软骨退变最明显，见图3。

2.4 改良Mankin组织学评分

各组豚鼠软骨组织的改良Mankin组织学评分：TN14003治疗组为3.16±0.65,T140治疗组为5.47±0.50,AMD3100治疗组为7.17±0.32，空白对照组为12.40±0.75。TN14003治疗组评分最低，软骨损伤明显减轻，空白对照组评分最高，软骨损伤程度最严重，两两比较差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。

2.5 免疫组织化学法检测白细胞介素1、肿瘤坏死因子α表达

与TN14003治疗组相比，其余各组豚鼠软骨组织中白细胞介素1(F=98.014)、肿瘤坏死因子α(F=74.027)的表达明显增多，其中空白对照组高于AMD3100治疗组，AMD3100治疗组高于T140治疗组，两两比较差异均有显著性意义(P<0.05)，见表2。

TN14003治疗组关节软骨侵蚀明显减轻，白细胞介素1、肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数量少，软骨细胞分布致密，线粒体无肿胀，细胞外基质增加；相比TN14003治疗组，T140治疗组及AMD3100治疗组软骨结构较完整，白细胞介素1、肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数量较多；空白对照组关节软骨侵蚀严重，白细胞介素1、肿瘤坏死因子α阳性细胞表达数量多，线粒体肿胀，空泡变性，见图4，图5。

3、讨论Discussion

作为一种促炎趋化因子，SDF-1与特异性G蛋白偶联受体CXCR4结合调节细胞运输和黏附[4,14]。研究表明，滑膜中的SDF-1与软骨细胞中的CXCR4结合，通过促进软骨细胞中转化生长因子β受体Ⅰ由激活素受体样激酶5向激活素受体样激酶1的转化，诱导关节软骨降解[15,16,17]。课题组前期研究发现，SDF-1/CXCR4信号通路通过释放基质金属蛋白酶13直接诱导骨关节炎软骨外基质降解，软骨外基质的完整性被破坏，直接降低了软骨的力学性能，并可能在骨关节炎的进展中起到加速作用；通过加入CXCR4拮抗剂可以阻断SDF-1/CXCR4信号通路，进而抑制其对软骨外基质的破坏[18,19,20,21]。

目前常见的特异性CXCR4拮抗剂有TN14003、T140、AMD3100等，它们在许多疾病治疗中发挥着广泛的作用。AMD3100目前已被广泛应用于治疗骨关节炎疾病的大量基础研究[10]。作为一种特异性的CXCR4拮抗剂，AMD3100通过阻断SDF-1/CXCR4信号通路，显著降低血清中基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶13和SDF-1水平，减轻了基质金属蛋白激酶对软骨外基质的刺激作用，进而减轻豚鼠原发性关节炎的严重程度[11,12,13]。研究表明T140是一种14个残基的肽，对人类免疫缺陷病毒活性具有很高的拮抗作用，通过阻断SDF-1/CXCR4信号通路，降低软骨组织中Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的降解，减轻骨关节炎疾病模型中软骨组织的退变[22]。TN14003是基于T140设计的，TN14003是通过酰胺化T140的COOH末端并用非碱性极性氨基酸取代碱性残基来降低分子的总正电荷而产生的，TN14003在细胞毒性和稳定性方面明显优于T140[8]。

该实验通过对关节软骨组织进行苏木精-伊红染色、番红-固绿染色，结果显示TN14003治疗组仅有轻微的骨关节炎改变，关节软骨的基本结构完整，有较致密的软骨细胞外基质，软骨细胞分布密集，关节软骨表面无明显损伤、结构断裂，无软骨水肿、退变的病理改变；空骨陷窝较少，无纤维化。T140治疗组及AMD3100治疗组的软骨损伤程度均较TN14003治疗组稍加重，较空白对照组明显减轻。空白对照组可见明显的软骨损伤，软骨退变最为显著，软骨面明显变薄，表层软骨细胞脱落、排列紊乱无序，细胞核染色不均匀，含少量的松质骨，空骨陷窝较多，可见明显纤维化。通过Mankin组织学评分评估软骨损伤严重程度，空白对照组Mankin评分最高，其次是AMD3100治疗组和T140组，TN14003治疗组Mankin评分最低。实验结果表明，3种CXCR4受体拮抗剂均可在体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路，减轻豚鼠原发性骨关节炎的严重程度，其中TN14003组的治疗效果明显优于其他组。

众所周知，炎性细胞因子参与了骨关节炎的发生和发展。在这些细胞因子中，白细胞介素1和肿瘤坏死因子α通过刺激基质金属蛋白酶和各种炎性细胞因子的释放，如一氧化氮、前列腺素E2和环氧合酶2等，抑制聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成，在骨关节炎软骨细胞外基质的降解中起关键作用[23,24,25,26]。该实验采用免疫组织化学法观察关节软骨组织中白细胞介素1、肿瘤坏死因子α的表达，结果可见TN14003治疗组关节软骨侵蚀明显减轻，软骨细胞分布致密，线粒体无肿胀，细胞外基质增加；T140治疗组及AMD3100治疗组软骨结构较完整，阳性细胞表达数量多于TN14003治疗组；空白对照组关节软骨侵蚀严重，软骨细胞阳性表达率多，线粒体肿胀，空泡变性，结果提示3种CXCR4受体拮抗剂均可在体内阻断SDF-1/CXCR4信号通路，降低滑液中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平，其中TN14003治疗组的白细胞介素1和肿瘤坏死因子α表达水平低于其他组。

此次实验选择Hartley豚鼠作为自发性骨性关节炎动物模型，与人类骨关节炎的病理进展存在差异性；实验治疗时间短，未能进行不同时间段的治疗效果比较。因此，进一步工作应该选取小型猪或猴子作为实验动物模型，进行不同时间段的治疗研究，用以验证不同CXCR4拮抗剂对骨关节炎病理进展的延缓作用。

综上所述，CXCR4拮抗剂AMD3100、T140和TN14003均可通过与CXCR4竞争其配体SDF-1，使SDF-1/CXCR4信号通路失活，降低滑液中白细胞介素1和肿瘤坏死因子α的表达水平，抑制软骨细胞凋亡，减少软骨基质降解，从而减轻骨关节炎的病理改变；但AMD3100和T140对骨关节炎的治疗效果有限，TN14003的治疗效果明显优于AMD3100和T140，该实验对未来研究骨关节炎治疗的最佳候选药物提供了实验依据。

参考文献:

[3]马珂李晓林,李彦林,等.T140体依外阻断SDF-1ICXCR4信号通路阻止人关节软骨Ⅱ型胶原蛋白降解的研究[J].实用医学杂志,2014,30(12):1879-1882.

[4]蒙旭晗.三种拮抗剂体内靶向阻断SDF-1/CXCR4信号通路调控关节软骨退变的研究[D].昆明:昆明医科大学,2018.

[5]李商林,王国梁,漕斌等.体外阻断基质细胞衍生因子1CXC趋化因子受体4信号通路后人关节软骨组织Ⅱ型肢原和聚集蛋白聚糖的表达[J].中国组织工程研究.2012,16(45):8607-8610.

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文章来源:何璐,李彦林,蒙旭晗,王国梁,杨腾云,廖欣宇,周晓翔,杨光.C-X-C趋化因子受体4拮抗剂延缓豚鼠关节软骨的退变[J].中国组织工程研究,2022,26(14):2150-2154.