膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是临床常见的退行性疾病[1],以关节软骨退变、滑膜炎症、软骨下骨改变、半月板损伤等为主要病理变化，以疼痛、肿胀、僵硬和功能障碍为主要临床表现[2],部分患者可出现持续性或严重关节肿胀[3]。KOA多呈慢性渐进性发展[4],随着时间的推移，由于膝关节的软骨不断被破坏，滑膜增生情况加重，最终出现关节无法完全伸展、关节僵硬甚至膝关节畸形，严重影响患者生活质量。

1、细胞焦亡

细胞焦亡是一种细胞程序性死亡方式，细胞焦亡过程即细胞形态膨胀变形、细胞膜破裂，细胞内容物释放激活炎症因子引发强烈的炎症反应[5],同时伴有染色体脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid, DNA)的断裂。一般情况下，细胞焦亡属于一种机体的自我保护机制，是一种自身的免疫反应，外来致病因素侵袭时，适量细胞焦亡可激发机体免疫机制，利于清除外因；而过度的细胞焦亡则会使炎症反应加重，不断释放的炎性因子，可导致激烈的炎性反应，造成细胞组织坏死，出现全身性炎性反应，如发热、休克等严重情况[6]。

1.1 细胞焦亡的机制与途径

当发生细胞焦亡时，细胞膜内外的离子失衡，导致细胞内外出现渗透压，焦亡的细胞在形态学上表现为细胞膜表面形成了10～15 nm的孔洞，细胞外液快速进入细胞内，引起细胞膨胀，焦亡的细胞核与凋亡的细胞核不同，其维持了核膜与核仁的完整性[7],它是一种由半胱氨酸蛋白酶1(caspase-1)激活的细胞死亡形式[8]。细胞焦亡包括经典和非经典两种途径[9],其中经典途径包括病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)与损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs),前者有病菌感染、DNA损伤等诱导所致，后者由蛋白质、植入物碎片诱导所致。

经典模式的途径依赖于caspase-1[10],当机体受到外因不良刺激后，NOD样受体(nucleotidebinding oligomerization domain like receptors, NLR)或烟碱型受体2(nicotinic receptor2,NR2)被激活，从而直接激活了caspase-1,它一方面切割了Gasdermin(GSDM)家族蛋白，形成有活性的多肽蛋白，该蛋白转移至细胞膜上，对其造成空洞样破坏，还会导致K+的外流，间接诱导了含Pyrin结构域3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)炎症小体的聚合[11];另一方面caspase-1会对炎症因子IL-1β、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的前体进行切割，使其具有活性，从而释放引起炎症引发焦亡。

非经典模式的途径[12]依赖于caspase-4/caspase-5/caspase-11,当机体受到外界病原菌的感染后，激活caspase-4/caspase-5/caspase-11蛋白(在人源的细胞里激活的是caspase-4/caspase-5,属源的细胞里激活的是caspase-11),一方面对 GSDMB 进行切割，形成多肽蛋白，破坏细胞膜；另一方面，在切割GSDMD的N端形成的活性多肽蛋白又可以激活NLRP3炎症小体，再次激活caspase-1,又能对炎症因子IL-1β、IL-18的前体进行切割，使其具有活性，释放至细胞膜外引起炎症引发焦亡[13]。

1.2 炎症与细胞焦亡的关系

根据细胞焦亡的机制和途径，caspase-1/caspase-4/caspase-5/caspase-11、炎症小体以及膜孔蛋白GSDM都与细胞焦亡引发炎症有关。

含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase)属于半胱氨酸蛋白酶，对细胞程序性死亡的调控起到了重要意义[14]。其中caspase-1是细胞应对炎症的关键[15],有活性的caspase-1可以水解蛋白，包括白细胞介素-1β前体(pro-IL-1β)和白细胞介 素-18 前体(pro-IL-18)。外界因素和内源性介质都会激活caspase-1启动免疫应答对抗炎症，但是过度的激活则会导致免疫炎症性疾病的发生。有研究表明，caspase-1抑制剂能有效抑制其活性，阻断炎症反应的进程[16]。

炎症小体由上游感受器蛋白组成，分为NLR家族和AIM2两类，其包括刺激感受器模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)、ASC和下游的caspase-1蛋白组成的蛋白复合物[17]。NLRP3是目前临床研究最为透彻的一种炎症小体[18],当启动 NLRP3 炎症小体之后，NLRP3方可广泛被激活，如三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate, ATP)、离子通量、线粒体功能障碍等。在致病因素的刺激下，对其激活可以起到保护细胞的作用；但在非致病因素的刺激下，可诱导线粒体失衡、NLRP3去泛素化、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD,ASC)线性泛素化。NLRP3的泛素化[19]可以防治炎症性疾病，其中起到负性调控的E3泛素连接酶可将NLRP3失活，减少感染的风险。

膜孔蛋白GSDM[20]是细胞焦亡过程的效应蛋白，其主要依赖于经典模式中的caspase-1和非经典模式中的caspase-4/caspase-5/caspase-11,激活后切割GSDM家族蛋白有活性的N端，使其对细胞膜形成孔道，从而释放IL-1β和IL-18,募集更多的炎症细胞，使得炎症反应进一步加剧。GSDMD被广泛研究[21],其N端不仅可以参与感染过程直接杀死游离细菌，还起到警报作用，募集免疫细胞消除病原体并诱发病理性炎症。

2、细胞焦亡与KOA

KOA的主要病理机制为软骨受损分解、软骨细胞死亡等[22],研究发现基因表达错误是引起软骨细胞非正常死亡的原因[23];当软骨细胞受到不良刺激时，早期细胞炎性反应可以帮助清除不利因素，如果炎性反应激烈，则可能导致代偿调节失衡出现细胞死亡，软骨组织破坏等现象[24];软骨组织损伤可引起松质骨丢失，软骨下皮质骨板变薄，病变持续发展，软骨下皮质骨板逐渐增厚，钙化软骨不断侵袭关节软骨向前矿化，从而使关节软骨越来越薄，同时伴有蛋白聚糖的丢失和纤维震颤，晚期表现为极薄的关节软骨和软骨下硬化[25]。

2.1 NLRP3、AIM2与膝关节炎

非免疫源性的软骨细胞也可导致细胞焦亡。KOA中脆薄的软骨细胞不断受到机械刺激后可通过线粒体损伤等途径产生DAMPs, 从而激活NLRP3炎症小体，而线粒体死亡出现的氧化线粒体DNA以及融合蛋白对NLRP3的上调都会诱导软骨细胞的炎性死亡[26]。有研究证实，NLRP3参与羟基磷灰石诱导膝关节滑膜炎的产生[27],其作为IL-1β的上游激活蛋白，在IL-1β刺激这些通路的激活过程中发挥关键作用，参与了多种炎症通路，如核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(nuclear factor-κB,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、 磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)通路。同时，NLRP3被激活后，分泌基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13,降解软骨基质，引发软骨损伤，被破坏的软骨细胞又可再次导致细胞焦亡，形成恶性循环导致组织损伤，病情加重。通过对机制的解读，针对KOA可以采取对NLRP3的调控，抑制软骨细胞的焦亡，从而在达到控制炎症的基础上，选择增加软骨细胞活性的药物[28],延缓KOA的退变进程，为临床治疗KOA提供思路。

此外，E3泛素连接酶作为泛素化正性、负性调节因子，通过靶向对炎症小体进行调控[29]。在负性调节中，多巴胺受体D1可通过其诱导NLRP3的泛素化，抑制炎症小体被激活，对于KOA中可以减轻软骨组织的降解，改善软骨损伤；在正性调节中，例如血浆E3泛素连接酶-2(Pellino-2)在NLRP3的负性泛素化调控中可能出现两种不同的情况[30],细菌中的细胞壁成分促使NLRP3与Pellino-2联合产生聚泛素化现象，从而激活炎症小体。同时，Pellino-2泛素化出现的IRAK1的泛素化则会起到抑制NLRP3炎症释放的作用[31]。对NLRP3中E3泛素连接酶的把控，做到在控制膝关节炎症的同时，减少过度免疫抑制引发临床感染的风险。

在正常情况下，AIM2在免疫细胞中极少表达，但当机体因环境因素或感染时，AIM2通过下游的ASC衔接蛋白，激活caspase-1,切割了炎症因子IL-1β、IL-18释放于细胞外诱发炎症[32]。短期的炎症诱发是机体的自我保护行为，能有效控制炎症的进展，但长期慢性炎性刺激或强烈炎性反应可引起组织严重病理变化。在DNA激活AIM2炎性小体引发的内皮细胞焦亡的小鼠实验中[33],DNA可以刺激内皮细胞AIM2的活化，故得出AIM2的表达离不开配体DNA的参与；同时ASC作为其传导的一部分也是不可或缺的。通过对潜在抑制剂的挖掘[34],发现了一种新的人类干扰素γ诱导蛋白16(recombinant interferon gamma inducible protein 16,IFI16)转录异构体IFI16-β在与AIM2的相互作用下能有效阻止AIM2-ASC的结合。此外还发现了一些能够阻断AIM2炎症小体的药物，如RGFP966、穿心莲内酯、EFLA945(一种水溶性红葡萄藤叶提取物)等。在膝关节炎症的控制方面，对于DNA-AIM2与AIM2-ASC两种信号通路阻断剂的研究也是未来需要深挖的一大重点。

2.2 IL-1β与KOA

IL-1β是退行性关节病变的代谢调节因子[35],可诱导软骨基质降解酶类基因表达，刺激成纤维细胞、软骨细胞等分泌多种炎症介质，使软骨损伤加重膝关节炎症反应[36]。有研究显示，caspase-1在骨关节炎中较caspase-3/9明显升高[37],其转化的IL-1β也随之升高，被证实在骨关节炎发病中起到关键作用[38]。IL-1β 由活化的巨噬细胞产生，与KOA的疼痛、肿胀密切相关，关节腔液体中的IL-1β含量越高，说明炎症程度越重[39]。同时，IL-1β能诱导软骨细胞和滑膜细胞的自分泌，促进软骨及滑膜组织蛋白金属酶、辅助B细胞生长、诱导内皮细胞黏附因子的表达，还会刺激滑膜细胞释放前列腺素E2,使血管充血扩张渗出，促进滑膜细胞黏附因子的释放，溶解周围骨组织，抑制软骨细胞胶原蛋白的产生，引发炎症与骨吸收造成关节破坏[40]。除此之外，KOA患者关节滑液中IL-1β的含量明显升高，其存在于膝关节的软骨细胞，具有高度的敏感性，长期大量产生抑制合成因子(如蛋白聚糖和Ⅱ型胶原)的表达[41],破坏软骨组织的稳定，组织破坏后会再次产生炎症刺激，又会增加IL-1β的表达，如不及时控制，则会出现关节软骨的损坏、关节疼痛肿胀，严重时会导致膝关节运动障碍，影响患者的日常生活能力。

2.3 ASC与KOA

关于组成蛋白复合物之一的ASC不仅参与炎症激活还在细胞之间起到联络作用[42]。其中一个结构完整的亚型ASC-b, 两者都能够与NLRP3和下游的caspase-1结合促进 IL-1β 的分泌，但ASC-b相比ASC多出了部分铰链区[43],能够为NLPR3提供炎性体平台。两者均具有完整的Pyrin结构域(pyrin domain, PYD)和caspase募集结构域(caspase recruitment domain, CARD)[44],共同表达增加了更多炎症因子的释放，还会激活无菌性炎症的级联并不断放大激活。当KOA急性发作时，外周血液中会产生高表达的ASC和ASC-b参与了下游炎症反应，使骨破坏因子不断上升，产生剧烈的炎症反应，同时导致患者产生局部关节肿痛，表达成骨细胞重组人血管生成素样蛋白4(recombinant human angiopoietin-like protein 4,ANGPTL4)促进破骨细胞的增殖和骨基质降解却抑制了成骨细胞，与炎症相关的骨破坏因子异常分泌，最终导致了骨质的破坏。

在细胞焦亡激活的过程中，上述蛋白和细胞因子均有参与炎症因子的表达，但彼此之间存在差异，各个因子导致KOA的具体作用机制仍需进一步探讨。

3、中医药调控细胞焦亡在膝关节炎中的应用

KOA是临床常见的退行性疾病，其主要病理表现为关节软骨退变、关节周围骨赘形成、关节软骨下骨质硬化及滑膜炎性增生。中医认为，KOA属于“痹证”的范畴，与风、寒、湿、热等外邪侵袭人体，导致气血运行不畅、经络痹阻有关[45]。中医药在膝关节病防治中发挥重要作用，研究发现中医药可以调控细胞焦亡保护膝关节软骨及滑膜组织，但调控机制的临床干预或中医药机制探讨有待进一步深入。

谢芳等[46]采用改良Hulth造模法建立大鼠膝关节炎模型，给予活膝汤灌胃4周后发现，活膝汤可以通过降低CC趋化因子受体2型(CC chemokine receptor 2,CCR2)、趋化因子配体2(CCL2)、p-p65、caspase-1的表达水平，起到补益肝肾、除湿散寒、活血通络的功效，从而抑制软骨细胞焦亡，减缓大鼠膝关节软骨的退变。王甜甜[47]通过构建外伤性KOA大鼠模型研究艾灸干预对大鼠膝骨关节的影响，发现艾灸可以通过下调p38MAPK信号通路，对NLRP3炎性小体介导的大鼠软骨细胞焦亡产生抑制效果，减少软骨细胞外基质的降解，从而起到疏经通络、调理气血，保护软骨细胞的作用。何花等[48]采用Hulth法建立KOA大鼠模型，通过28 d的灌胃后发现，丹紫康膝冲剂通过对kappa B抑制因子激酶(inhibitor of kappa B kinase, IKK)/核因子κB的抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκB)/NF-κB信号通路活化的抑制，可以减少大鼠关节软骨炎性因子的表达，减轻软骨的病理性损伤，并且在安全剂量下丹紫康膝冲剂的用量与效果呈正相关。林晴等[49]通过药物干预二代软骨细胞发现，荣筋拈痛方中的补肝肾强筋骨药物与祛风湿止痹痛药物，分别有刺激关节软骨蛋白多糖合成和抗炎镇痛的作用，可以抑制炎症因子表达保护软骨，调控软骨细胞 NLRP3/caspase-1/GSDMD途径来降低细胞焦亡引起的炎症反应。蔡猛等[50]采用Hulth法建立大鼠骨关节炎模型，药物干预8周后，观察各实验室指标发现三七总皂苷中的PNS来源于三七的根茎和根部，具有消肿止痛、散瘀止血等功效，其可能通过抑制TLR4/NLRP3/caspase-1信号通路，降低大鼠软骨细胞焦亡。金灵璐等[51]采用改良Hulth造模法建立大鼠KOA模型，药物干预8周后发现，乌头汤功擅温阳通络、宣痹止痛，可以通过抑制大鼠软骨caspase-1、NLRP3、IL-18、IL-1β的相关表达，抑制大鼠软骨细胞焦亡，改善软骨退变。

从上述研究可以看出，中医药对于细胞焦亡的研究还处于基础动物实验方面。从这些实验中可以发现中医药主要通过调控caspase-1、NLRP3、NF-κB、IL-18、IL-1β等相关表达来抑制KOA的细胞焦亡。中医药调控细胞焦亡在KOA的研究方面，以中药复方实验多见，中药单体及中药活性成分的研究较少，针灸、手法等方面的研究也相对薄弱。

4、讨论

目前，细胞焦亡仍然是被持续关注的研究话题，它是调节细胞炎症免疫机制的保护性过程。本文探讨导致KOA最主要的三大因素：炎症小体NLRP3和AIM2、炎症因子IL-1β以及ASC,虽然已有部分研究表示KOA与细胞焦亡存在一定的关联，对细胞焦亡的通路进行干预可阻断炎症进展，如抑制TLR4/NLRP3/caspase-1信号通路、抑制IKK/IκB/NF-κB信号通路、下调p38MAPK信号通路等，但是这些研究对于调控度量的把控仍然没有一个具体的结果。

细胞焦亡在靶向药物的研究中有了一定的进展，但针对KOA类别的相关研究均处于动物实验阶段，对改善炎症反应的途径尚不明确。在能够保证“骨稳态”的基础上，相对温和有效地采用中医药调控方式延缓KOA的疾病进展，从中医学气血、经络的理论探讨调控细胞焦亡的作用机制。因此，今后的研究需要攻破细胞焦亡在其他分子机制上的作用，同时基于中医药调控方面的基础动物实验需进一步深入研究并积极探讨KOA的预防和治疗，为KOA的临床诊治提供新的思路和方案。

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文章来源:许晚舟,李海婷,郭珈宜等.中医药调控细胞焦亡治疗膝骨关节炎[J].中医学报,2024,39(02):319-324.