非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是全球范围内最常见的慢性肝病之一，由于生活节律和饮食结构的改变，该病患病率逐年上升。NAFLD指没有大量饮酒等继发性原因或其他肝病病因的情况下，肝脏中过多的脂肪堆积，包括一系列进行性疾病，如单纯脂肪变性、脂肪性肝炎、不同程度肝纤维化和肝硬化等[1]。NAFLD的发病机制复杂，大量证据表明氧化应激、遗传易感性、炎性反应和胰岛素抵抗等因素都在NAFLD的发生发展中起关键作用[2,3]。目前，还没有正式批准用于特异性治疗该病的药物，只能通过合理搭配饮食、加强体育锻炼配合适量的降脂药物改善肝脏病理情况，因此NAFLD的诊断和治疗仍面临巨大挑战[4]。丹参酮(Tan)ⅡA作为中药丹参中发挥重要作用的亲脂性成分之一，具有抗炎、抗凋亡等多种药理作用[5]。研究发现，TanⅡA在肝脏疾病的发生发展中都表现出积极的治疗作用，它能通过调节炎症反应和细胞凋亡，抑制肝纤维化的进程，发挥保肝作用[6～8]。网络药理学可以帮助筛选药物和疾病靶点，识别关键靶点和信号通路之间的关系，探索药物治疗疾病可能存在的机制[9,10]。因此，本研究以网络药理学与动物实验相结合的方法，多角度对TanⅡA治疗NAFLD的作用机制进行探讨，以期为NAFLD的临床治疗和新药开发提供参考。

1、材料和方法

1.1 TanⅡA和NAFLD的靶点收集

将从公共化合物数据库(Pubchem)获得Tan ⅡA的Smiles ID导入瑞士靶点预测数据库(Swisstarget),获取化合物靶点，其次通过Genecard、中药分子机制生物信息学分析工具(Batman-TCM)、中药高通量实验与文献指导数据库(Herb)和中药系统药理学数据库与分析平台(Tcmsp)检索化合物靶点，将所有靶点通过Uniprot转换为标准化格式；以“Nonalcoholic fatty liver disease”为搜索词，在人类基因数据库(Genecard)、国家生物技术信息中心(NCBI)及疾病基因网络数据库(DisGeNET)检索靶点基因；制作Venn图展示其交集靶点基因。

1.2 蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)网络构建和分析

利用交集靶点信息在相互作用基因/蛋白质检索工具(String)构建PPI网络，运用Cytoscape3.8.0软件优化网络图，通过软件中的拓扑[根据度(degree)值筛选]和MCODE分析[默认参数度数截止值(Degree Cutoff)=2,K算法(Core)=2]筛选重要基因簇和核心靶点[11,12]。

1.3 京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路和基因本体论(GO)富集分析

对筛选获得的基因进行KEGG通路富集和GO富集分析，将校正后P≤0.05的条目通过气泡图进行可视化展示。

1.4 实验动物

于北京维通利华公司购买18只SPF级健康雄性SD大鼠[合格证号：SCXK(京)2016-0006],体质量(200±20)g, 饲养于山西中医药大学动物实验中心。饲养环境：温度(25±2)℃、湿度(55±5)%、每日明暗交替为12 h/12 h。大鼠适应性喂养1 w后，采用随机数字表法，将大鼠随机分为正常组、模型组和TanⅡA组(n=6)。实验符合山西中医药大学伦理委员会要求，批准号2019LL016。

1.5 主要实验试剂

高糖高脂饲料(北京诺康源生物公司);Tan ⅡA磺酸钠(货号：69659-80-9,上海第一生化药业公司);油红O染液(货号：G1260)和苏木素-伊红(HE)染液(货号：G1120,北京索莱宝科技公司);总胆固醇(TC,货号：A111-1-1)、三酰甘油(TG,货号：A110-1-1)、谷草转氨酶(AST,货号：C010-2-1)和 谷 丙 转 氨 酶(ALT,货号：C009-2-1,南京建成生物公司);Toll样受体(TLR)4(货号：A00017-3)、缺氧诱导因子(HIF)-1α(货号：PB9253)、核因子(NF)-κB(货号：A00284-1)抗体(武汉博士德生物公司)。引物序列(5′-3′):TLR4上游：ATGGCATGGCTTACACCACC,下游：GAGGCCAATTTTGTCTCCACA;NF-κB上游：TCCCCCCAGA-GACCTCATAGT,下游：TGGAAATTCCTGATCCCGA-C;HIF-1α上游：GATGACGGCGACATGGTTTAC,下游：CTCACTGGGCCATTTCTGTGT;GAPDH上游：A-GGTCGGTGTGAACGGATTTG,下游：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

1.6 NAFLD大鼠模型建立

正常组常规饲料喂养；模型组和Tan ⅡA组先高脂高糖饲料喂养3个月(68.6%基础饲料+10%蔗糖+20%猪油+0.2%胆酸+0.2%丙硫氧嘧啶+1%胆固醇);其中Tan ⅡA组在2个月后每天给予大鼠腹腔注射10 mg/kg Tan ⅡA磺酸钠1次[13],此期间模型组和正常组腹腔注射等量生理盐水。观察记录各组平时精神状态、活动度和体质量等情况，治疗结束后，提取血清及肝组织，低温保存准备实验。

1.7 肝脏组织病理学检测

取适宜大小的肝组织，制备冰冻切片，对切片行常规HE和油红O染色，固封后并在镜下观察各组病理学变化。

1.8 酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清TC、TG、ALT、AST含量

每组取6只血清样本，参照ELISA试剂盒说明书进行标准品和样本的加样、孵育和洗板等流程，最后利用酶标仪观察记录各实验孔在450 nm波长处的吸光度(OD)值，并参照标曲，分别计算TC、TG、ALT、AST含量。

1.9 RT-聚合酶链反应(PCR)技术检测肝组织TLR4、NF-κB和HIF-1α mRNA表达水平

提取各组肝组织总RNA,根据反转录试剂盒要求合成cDNA;通过RT-PCR试剂盒进行PCR扩增(设定条件为：95 ℃ 30 s, 1个循环；95 ℃ 5 s, 60 ℃ 34 s, 40个循环)。通过2-ΔΔCt公式计算分析所得结果。

1.10 Western印迹检测肝组织TLR4、NF-κB和HIF-1α蛋白表达

提取肝总蛋白并且计算浓度，根据浓度加样进行电泳操作，湿转法转运2 h后用5%脱脂奶粉封闭2 h左右，洗膜后加入所需一抗放入冰箱4 ℃过夜。隔天先用Tris盐酸液冲液吐温(TBST)洗膜5×5 min, 然后室温条件下加入二抗孵育1 h, 再次洗膜3×10 min, 滴加显影液适当摇匀上机显影，拍照保存并分析各组蛋白水平差异。

1.11 统计学分析

采用GraphPad Prism8软件进行分析，多组间采用单因素方差分析，进一步两两比较时，方差齐采用LSD检验，方差不齐选用Tamhane检验。

2、结果

2.1 靶点的收集和PPI网络的构建

获得TanⅡA靶点294个，NAFLD靶点1 770个，交集靶点150个。把String数据库导出的TSV文件通过Cytoscape进行可视化，共含150个节点，2 610条边，平均度值为35.5,节点大小、颜色深浅与在该网络中的重要性呈正比，见图1。

2.2 拓扑分析和MCODE聚类分析

拓扑分析筛选出60个关键靶点(分值大于2倍平均分),取排名前20的靶点进行绘图，图中横坐标为对应的度值，见图2。MCODE分析共得到4个基因簇包含4个核心基因，分别为TLR4,核受体亚家族1I组成员(NR1I)2,核因子红细胞2样因子(NFE2L)2,低密度脂蛋白受体(LDLR),见表1、图3。

图1 PPI网络

图2 拓扑分析条形图

表1 MCODE聚类分析表

图3 MCODE聚类分析基因簇

2.3 GO富集分析

GO分析共富集到2 638条生物学过程(BP)、74项细胞组分(CC)和178项分子功能(MF)。TanⅡA-NAFLD参与的BP主要是氧化应激反应和缺氧反应等，主要发生在膜筏、膜区等CC间，同时与DNA结合转录因子结合功能关系密切，见图4。

图4 GO富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

KEGG共富集到165条信号通路。这些靶点主要涉及的信号通路有TLR、HIF-1和肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等，同时与乙型肝炎等疾病密切相关，见图5。

图5 KEGG信号通路分析

2.5 各组肝组织TLR4、NF-κB和HIF-1α mRNA和蛋白表达比较

与正常组比较，模型组肝组织TLR4、NF-κB和HIF-1α mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组相比，TanⅡA组肝组织以上指标明显降低(P<0.05,P<0.01),见图6、表2。

图6 各组肝组织TLR4、NF-κB和HIF-1α蛋白相对表达

表2 各组肝组织TLR4、NF-κB和HIF-1α mRNA和蛋白表达比较

2.6 各组肝组织病理学变化

正常组肝细胞形态正常；模型组肝细胞肿胀伴大量炎细胞浸润，同时出现大量脂滴；与模型组比较，TanⅡA组肝组织内脂质积累减少，炎细胞浸润减轻，脂滴的数量和大小均有所减少，见图7。

图7 各组肝组织病理学(×200)

2.7 各组血清ALT、AST、TC和TG比较

与正常组相比，模型组血清中TC、TG、AST和ALT含量明显升高(P<0.01);与模型组比较，TanⅡA组血清中TC、TG、AST和ALT含量明显降低(P<0.01),见表3。

表3 各组血清指标含量比较

3、讨论

NAFLD包括一系列慢性肝病，特征是无大量饮酒情况下肝脏脂肪堆积过量，伴或不伴肝脏炎症或纤维化的发生[1,14]。NAFLD影响全球约25%的人口，超重和肥胖的流行推动了其代谢条件的发展，使其患病人数和严重程度逐年增加[2]。NAFLD的临床症状主要包括脂肪变性和以炎症、肝细胞损伤和肝纤维化为特征的脂肪性肝炎，后期可发展为肝硬化和肝细胞癌[3,15]。由于发病机制复杂，所以目前缺乏有效治疗的特异性药物[4],仅能通过限制能量摄入和提高运动量进行逐步改善，因此探索新药治疗策略是有必要的。中医理论认为，中药丹参归属肝经，具有保肝功效[16]。Tan ⅡA是从丹参根部提取的主要脂溶性单体成分，具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用。研究发现，高脂饮食小鼠经Tan ⅡA治疗后，高密度脂蛋白胆固醇水平明显升高[17],同时Tan ⅡA通过降低肝脂肪变性中的氧化应激水平可以抑制细胞凋亡[13]。本研究采用高脂饮食喂养的方法，成功建立了NAFLD大鼠模型[18]。Tan ⅡA磺酸钠是由Tan ⅡA衍生的水溶性物质，可以用作Tan ⅡA的替代品进行治疗。ALT、AST、TG和TC是反映脂肪肝损害的主要指标。本研究提示，TanⅡA可以有效抑制脂肪生成和炎症的发展，对NAFLD的严重程度有改善效果。

脂肪组织和肝脏中炎症通路的激活依赖于TLRs等通路，并且主要合并在 NF-κB的激活中。TLRs是机体的固有免疫受体，激活后可以诱导不同促炎因子和趋化因子的产生，在先天和适应性免疫功能中发挥关键作用，尤其是TLR4,已被证明可以通过调节炎症反应参与多种肝病的发展[19]。NF-κB是位于TLRs下游信号通路的重要NF,TLRs与细胞外相应配体结合后激活胞内下游分子髓样分化因子(MyD)88、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF)6,促进NF-κB入核与DNA特异性序列结合，调节炎症因子、细胞抗凋亡等基因的转录，引发炎症反应。TLRs信号在健康肝脏中受到抑制，当炎症疾病发生时，TLRs信号增强，数据表明，TLR4/NF-κB通路的上调在介导脂肪变性的发展中起关键作用[20]。此外，NAFLD病程演变过程中脂质过度沉积会使肝细胞肿胀坏死和肝窦变形，加重局部微循环障碍，导致肝细胞内缺氧和缺血的发生。缺氧环境在增强肝脏细胞外基质沉积、诱导肝脏炎症发生和加重肝损伤的过程中发挥重要作用[21]。HIF-1位于NF-κB的下游，可直接与HIF-1α转录起始位点上游的第197/188位点结合进行转录[22]。HIF-1α是肝脏中重要的缺氧敏感性NF,TLR4可以通过激活NF-κB诱导HIF-1α的表达，从而促进缺氧状态下对炎症信号的易感性。Zhao等[23]研究发现，TLR4介导的HIF-1α激活和HIF-1α诱导的TLR4表达会形成炎症-缺氧正反馈回路，进而可以协同促进上皮性卵巢癌的发展；Han等[24]发现，TLR4/NF-κB信号通路与HIF-1α之间相互作用可以促进口腔鳞状细胞癌的进展，均提示缺氧反应和炎症信号通路之间的重要联系。本研究提示，TLR4、NF-κB和HIF-1α存在正相关性，TLR4信号与HIF-1α通路之间可能存在串扰，协同作用促进NAFLD的进展。TanⅡA已被证明具有广泛的生物活性，可以通过调节多种信号通路在多种代谢或急慢性疾病的治疗中发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用。刘文平等[25]研究证明，TanⅡA可以通过下调小鼠肝组织中TLR4、高迁移率族蛋白(HMG)B1表达，减轻肝脏缺血再灌注损伤介导的肝损伤。Liu等[26]发现，TanⅡA对大鼠肝星状细胞的抑制作用与TLR4、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路的调节有关。此外，Du等[27]发现，Tan ⅡA可以通过影响HIF-1和NF-κB信号通路改善小鼠的关节炎严重程度。董颖[28]发现，TanⅡA的抗肝纤维化和保肝作用机制可能与HIF-α的表达水平降低有关。因此，TanⅡA在抗炎和缺氧调节方面均有良好效果。本研究提示，TanⅡA可能抑制TLR4/NF-κB信号通路，下调HIF-1α水平，减少肝脏中的脂肪积累和炎症介质的释放，对NAFLD大鼠有较好的治疗作用。

综上，炎症和缺氧的协同作用机制可能在NAFLD发病中占重要地位。Tan ⅡA可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路，下调HIF-1α水平，降低脂质积累和炎症反应，有效改善NAFLD的症状。未来还应更加深入探讨其内在机制，以期为NAFLD发病机制的研究和新药物开发提供更多可能。

参考文献:

3吴剑平,肖海英,郑雪莲,等.白介素25及其相关因子在非酒精性脂肪肝患者血清及肝内的表达及其意义[J].第三军医大学学报,2021;43(1):83-90.

8郝健亨,李振城,孙薇丽.丹参酮ⅡA治疗自身免疫性肝炎的网络分析及实验验证[J].陆军军医大学学报,2022;44(10):1033-40.

25刘文平,张永川,张映林.丹参酮ⅡA在小鼠肝脏缺血再灌注损伤模型中的保护作用及机制[J].中国普外基础与临床杂志,2020;27(3):298-303.

28董颖.丹参酮ⅡA对肝纤维化大鼠肝组织HIF-1α及VEGF表达的影响[D].杭州:浙江中医药大学,2014.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(82074549,81470190);

文章来源:郝健亨,王海军,曹玉霞,等.丹参酮ⅡA治疗非酒精性脂肪性肝病的网络分析及实验验证[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5243-5249.