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骨髓间充质干细胞治疗慢加急性肝衰竭小鼠实验研究

2025-01-16 80 上传者：管理员

摘要：目的：研究骨髓间充质干细胞（hBMSCs）对慢加急性肝衰竭（ACLF）模型小鼠的治疗作用。方法：60只BALB/cJ小鼠随机分为正常组（n=8）和ACLF造模组（n=52），采用四氯化碳（CCl4）诱导法构建ACLF小鼠模型，ACLF造模组剔除死亡小鼠，随机分为模型组（n=11）、hBMSCs低剂量治疗组（n=12）、中剂量治疗组（n=12）、高剂量治疗组（n=12）。采用生化分析仪检测小鼠血清谷氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红素（TBIL）、总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）水平；超敏多因子发光法（MSD）检测血清白细胞介素（IL）-Iβ、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、趋化因子配体1（KC/GRO）水平含量；苏木素-伊红（HE）和Masson染色，评价肝组织病理损伤程度。结果：与正常组相比，模型组AST、ALT、TBIL、TP、ALB水平显著升高（F=5.409、26.27、21.20、23.44、22.81，均P<0.001）,AST/ALT比值显著降低（F=3.036,P<0.05）。与ACLF模型组比较，hBMSCs低、中剂量治疗组血清AST、ALT、TBIL水平显著降低（均P<0.05）；中、高剂量治疗组AST/ALT比值显著升高（均P<0.05）;hBMSCs低剂量治疗组血清IL-6、KC/GRO水平显著降低（均P<0.05）;hBMSCs低、中剂量治疗组IL-1β、TNF-α水平降低（均P<0.05），而在h BMSCs低、中、高剂量治疗组中IL-10均升高（均P<0.05）；低、中、高剂量治疗组TP、ALB、IFN-γ、IL-2、IL-5差异没有统计学意义（均P>0.05）;hBMSCs低、中剂量治疗组肝组织炎细胞浸润及坏死区域均显著减少（均P<0.05），肝组织胶原纤维阳性面积显著降低（均P<0.05）。结论：hBMSCs对CCl4诱导的ACLF小鼠模型具有显著的治疗作用，治疗效果未见剂量依赖，其中低剂量组治疗效果更佳。

关键词：
ACLF
人骨髓间充质干细胞
慢加急性肝衰竭
炎性因子
肝纤维化
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慢加急性肝衰竭（ACLF）是发生在慢性肝病基础上，引起肝脏急性代偿或失代偿，以肝外多器官衰竭和短期内高死亡率为特征的肝衰竭综合征[1]。在我国，ACLF是肝病相关死亡的主要原因，每10万人中约有2.53例患者[2]。临床多采用肾上腺皮质激素、人工肝等治疗方法，但疗效甚微，目前除肝移植外，无特异性的治疗方法，因此，亟待新的治疗手段出现。

ACLF的病因和诱因极其复杂，诊断标准、发病机制等存在诸多争议，目前认为全身性炎症及免疫失衡是ACLF的核心发病机制，这种免疫的不平衡导致了连锁的器官功能障碍，也使ACLF患者易于被感染[3]。尽管ACLF的28 d内死亡率高达32%，病程发展迅猛，但前瞻性临床队列研究认为ACLF病情仍具备可逆性[4]。干细胞以其多向分化、免疫调节、旁分泌、促进组织再生和血管生成等特性，在难治性疾病治疗方面具有广阔的临床应用前景[5]。在特定的细胞因子和生长因子作用下，如肝细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子等，干细胞在体内和体外均可分化成肝细胞样细胞[6]；间充质干细胞（MSCs）通过调节免疫细胞，抑制B细胞和调节性T细胞增殖和凋亡，发挥抗炎特性[7]。研究表明，MSCs通过降低促炎细胞因子分泌，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α）、白细胞介素（IL)-12和干扰素（IFN)-γ以及增加IL-10来调节炎症[8]。在多项评估MSCs治疗肝病的临床试验中，包括血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血清白蛋白（ALB）和总胆红素（TBIL）等肝功能指标均有显著改善[9]。基于以上背景，本研究探讨人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）对ACLF小鼠模型的保护作用并探究其药理机制，为干细胞用于ACLF的研究与临床治疗提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 实验细胞

本研究所用的异体人hBMSCs购自广州赛隽生物科技有限公司。

1.2 实验动物

BALB/cJ小鼠60只，SPF级，雄性，5～6周龄，体重19.0～23.0 g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008；动物合格证号：320727221100235054。实验小鼠饲养于天津中医药大学动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（津）2020-0005。本实验涉及与动物实验相关的内容，已通过天津中医药大学实验动物福利伦理委员会批准，批准号TCM-LAEC2021294。

1.3实验试剂

四氯化碳（CCl4），上海麦克林生化科技有限公司，批号C12896608；橄榄油，上海易恩化学技术有限公司，批号RH2374288；复方电解质注射液，上海百特医疗用品有限公司，批号S2009040;4%多聚甲醛固定液，福州飞净生物科技有限公司，批号20210903；超敏多因子发光法（MSD）细胞因子检测试剂盒，美国Meso Scale Discovery公司，批号K0081820；异氟烷，上海玉研科学仪器有限公司，批号S10010533。二甲苯（批号10023418），无水乙醇（批号100092683），中性树胶（批号10004160），国药集团化学试剂有限公司；苏木精-伊红（HE）染液套装（批号G1003），马松（Masson）染液套装（批号G1006），武汉赛维尔生物科技有限公司。

1.4 实验仪器

全自动生化分析仪Hitachi3100，日本日立公司；MSD超敏多因子电化学发光分析仪Meso QuickPlex SQ 120，美国Meso Scale Discovery公司；正置光学显微镜Nikon Eclipse E100，日本尼康；成像系统NIKON DS-U3，日本尼康；病理切片机RM2016，上海徕卡仪器有限公司。

1.5 实验方法

1.5.1 动物分组与造模

动物适应性饲养后随机分为正常组（n=8）和ACLF造模组（n=52），除正常组外，其余小鼠按5 m L/kg的剂量，腹腔注射10%CCl4橄榄油溶液，每周2次，持续8周。ACLF造模组随机分为模型组（n=11）、hBMSCs低剂量治疗组（n=12）、中剂量治疗组（n=12）、高剂量治疗组（n=12）。治疗组在继续CCl4诱导的同时，分别给予hBMSC0.5×106/次、1×106/次、2×106/次，模型组小鼠给予等体积复方电解质溶液，各组每周给予1次，连续4周，在最后1次给药后随即模型组、各治疗组按照4m L/kg的体积腹腔注射50%CCl4橄榄油溶液。正常组小鼠不做任何处理，作为对照。于末次干预3 d后进行相关指标检测，证明造模成功。

1.5.2 血清收集和指标检测

末次干预3 d造模成功后，小鼠异氟烷吸入麻醉后眼底静脉丛取血，室温避光静置30 min后，3 000 r/min离心10 min，收集并分装血清；Hitachi3100全自动生化分析仪检测血清中TBIL、AST、ALT、总蛋白（TP）、ALB;MSD超敏多因子电化学发光分析仪检测血清中IFN-γ、IL-Iβ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、趋化因子配体1(KC/GRO）、IL-10和TNF-α水平。

1.5.3 肝组织病理学检测

血生化分析取样完成后处死小鼠，取肝大叶用4%甲醛溶液固定48 h后进行脱水、石蜡包埋，取横切面制作蜡块后，进行HE染色和Masson染色，并全玻片扫描；使用Case Viewer和Image J软件，分析和统计Masson染色切片各肝组织胶原容积分数，即胶原容积分数=胶原纤维阳性面积/切片总面积×100%；肝组织损伤区域进行量化分析，即肝损伤区域占比=所有圈定坏死区域总和/肝切片总面积×100%。

1.6 统计学处理

本研究采用GraphPad Prism 8.0软件进行实验数据的统计分析，实验数据以表示，当数据符合正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析（One-way AVOVA）中最小显著性差异法（LSD）进行组间比较；当数据方差不齐，则采用One-way AVOVA中新复极差法检验（Dunnett′s T3）进行组间比较，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 hBMSCs对ACLF小鼠血清肝脏功能指标的影响

与正常组相比，模型组AST、ALT、TBIL、TP、ALB水平显著升高（F=5.409、26.27、21.20、23.44、22.81，均P<0.001),AST/ALT比值显著降低（F=3.036,P<0.05）。与模型组比较，hBMSCs低、中剂量治疗组血清AST、ALT、TBIL水平均显著降低（均P<0.01）；在hBMSCs中、高剂量治疗组AST/ALT比值显著升高（均P<0.05），低、中、高剂量治疗组TP、ALB未见显著差异（均P>0.05），见图1。

图1 各组肝功能指标比较

2.2 h BMSCs对ACLF小鼠血清炎症因子的影响

如图2所示，与正常组相比，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、KC/GRO、IL-5水平显著升高（F=5.380、4.655、11.51、6.781、8.898、11.88，均P<0.05),IFN-γ、IL-2未见显著差异（F=2.395、2.798，均P<0.05）。与模型组比较，hBMSCs低剂量治疗组IL-1β、IL-6、TNF-α、KC/GRO水平显著降低（均P<0.05）；中剂量治疗组血清IL-1β、TNF-α显著降低（均P<0.05）；高剂量治疗组IL-1β、IL-6、TNF-α、KC/GRO未见显著差异（均P>0.05），而IL-10在hBMSCs低、中、高剂量治疗组中均较模型组显著升高（均P<0.05）；低、中、高剂量治疗组IFN-γ、IL-2、IL-5未见显著差异（均P>0.05）。

2.3 hBMSCs对ACLF小鼠肝脏病理的影响

2.3.1 hBMSCs对ACLF小鼠肝损伤的影响

正常组小鼠肝组织细胞排列紧密，核圆居中，形态正常，肝小叶完整，肝索结构清晰。而模型组小鼠肝细胞结构疏松明显，空泡及颗粒变性区域增加，细胞钙化坏死区域增多，坏死区域内可见大量炎性细胞浸润（图3A）。

与模型组相比，hBMSCs各治疗组小鼠肝组织空泡及颗粒变性区域明显降低，肝细胞结构疏松状况均有改善；如图3B所示，hBMSCs低、中剂量治疗组肝细胞钙化坏死区域等损伤坏死面积较模型组显著减少（F=12.84，均P<0.05），高剂量治疗组有改善趋势，但无显著差异（P>0.05）。

图2 各组血清炎性因子变化比较

图3 hBMSCs对ACLF小鼠肝组织病理组织学的影响

2.3.2 hBMSCs对ACLF小鼠肝脏纤维化的影响

胶原纤维沉积是肝纤维化的形成的重要特征，Masson染色结果显示（图4A），正常组小鼠肝组织，除血管壁和胆管壁胶原纤维组织染成蓝色，其他区域未见明显纤维化。模型组小鼠肝小叶周围区域出现片状肝纤维化的表型，包绕形成假肝小叶，呈现显著胶原纤维阳性（F=32.28,P<0.05）。与模型组比较（图4B),hBMSCs低、中、高剂量治疗组肝纤维化片状区域减少，胶原纤维阳性面积显著降低（均P<0.05）。

图4 h BMSCs对肝组织纤维化的影响

3、讨论

ACLF是一种诱发因素和疾病进程极其复杂的综合征，是世界范围内常见的极具挑战性的医学难题。目前针对ACLF尚未有特异性药物，临床常规采取相应的病因和综合治疗措施，并积极防治并发症。因此，不断探索新的治疗手段和方法对ACLF患者防治具有重要意义。ACLF病理生理进程复杂，目前还没有完全阐明其发病机制，血清TBIL水平持续处于较高水平，是ACLF的重要特征之一[10]。肝细胞毒素CCl4被广泛应用于肝脏病理疾病模型的建立，后者的生化和形态学表征与人类肝脏疾病相似[11]。研究显示，CCl4通过抑制蛋白质合成、干扰细胞代谢过程等途径使小鼠肝组织在诱导4～6周后出现显著的生化指标改变，肝小叶单元病变开始形成，显示出早期纤维化迹象[12-14]。因此本研究采用CCl4腹腔注射方式构建ACLF小鼠模型，诱导至第6周，造模组小鼠血清TBIL水平显著升高，出现肝损伤表现时，证明造模成功。

干细胞能够通过自分泌或诱导旁分泌作用，促进机体生成营养因子和细胞因子，刺激肝细胞再生，抑制肝细胞凋亡，促进受损肝功能的恢复，保护由毒性物质或病毒所致的肝损伤[15-16]。本研究结果显示，反映肝脏疾病进程及预后的敏感指标TBIL、ALT、AST，经h BMSCs治疗后均有显著改善。

此外，干细胞能够迁移归巢至受损的肝组织，分化为肝样细胞，替代受损细胞器而发挥功能作用[17]。本研究中，治疗组小鼠肝组织空泡及颗粒变性区域明显降低，肝细胞结构疏松状况均有改善，肝纤维化片状区域减少，胶原纤维阳性面积显著降低，可能与干细胞分化为肝样细胞有关。然而值得关注的是，肝组织纤维化和损伤面积虽有改善，但病理状态仍未完全恢复正常水平，同时评价肝组织的蛋白合成和代谢功能的重要指标TP和ALB，均未呈现显著改善。这可能与造模后干细胞衍生的肝细胞占总肝细胞的比例相对较少，迁移分化的肝细胞短时期内无法补偿肝功能有关[18]。

系统性炎症是ACLF病理进程中对肝脏造成损伤的重要原因，而肝脏又在宿主防御和炎症调节中发挥着关键作用[19]。先前研究表明，肝损伤患者血液中TNF-α、IL-6等水平通常显著升高[20]，同时，这些炎症因子的释放促进肝组织巨噬细胞、中性粒细胞浸润，加速肝损伤的进程[21]。本研究中，hBMSCs显著抑制了IL-1β、IL-6、TNF-α、KC/GRO炎性因子的表达，促进抑炎因子IL-10的分泌，但炎性因子IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-4在血液中没有呈现规律性改变。研究普遍认为，炎症因子的变化与肝损伤进程密切相关，干细胞中许多可溶性因子或旁分泌作用参与损伤进程[22]，推测这种治疗作用是干细胞综合作用的结果，确切机制仍需更深入的研究。

本研究中hBMSCs对ACLF的治疗作用并未呈现出明显的量效关系。这可能与干细胞的来源与适应证的选择[23]以及宿主属性[24]存在一定的差异有关。但是，一定剂量范围内hBMSCs能够有效缓解ACLF引起的肝功能异常、肝组织纤维化，炎性因子失衡等，作用机制与干细胞多向分化、免疫调节、迁移归巢相关。本研究将为探索干细胞疗法用于A-CLF的防治和有针对性的干预提供理论支持。

基金资助:天津市教委科研计划重点项目(2022ZD053);

文章来源:闻家兴,杨阳,孟玉静,等.骨髓间充质干细胞治疗慢加急性肝衰竭小鼠实验研究[J].天津医科大学学报,2025,31(01):54-59.