肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是一种重要的院内致病菌，能够造成包括肺炎、肝脓肿、菌血症、尿路感染在内的多种感染[1,2,3]。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指没有慢性酒精摄入的情况下肝脏出现过度脂质积累，可以表现为包括非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化、肝硬化等在内的一系列的肝脏病变[4]。课题组前期研究首次报道了国际上首例细菌性自酿酒综合症合并非酒精性脂肪性肝炎的病人，并发现病人肠道中具有高产乙醇能力的肺炎克雷伯菌(high-alcohol-producing Klebsiella pneumoniae,HiAlc Kpn)是导致NAFLD的新病因[5]。通过对临床队列的研究发现，61%的NAFLD病人肠道内都存在HiAlc Kpn。肠道菌群是机体内源性乙醇的主要来源[6],乙醇及其代谢产物乙醛能够增加肠通透性，促进细菌的代谢产物(如脂多糖等)穿过肠道通过门静脉到达肝脏，脂多糖能通过Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)刺激巨噬细胞与血小板，进而增加肝损伤[7,8]。因此，乙醇是HiAlc Kpn的重要毒力因子，能够影响HiAlc Kpn产乙醇的重要代谢基因有可能成为抑制HiAlc Kpn产乙醇潜在的药物靶点。

在大肠杆菌中，碳水化合物能够通过糖酵解被转化为丙酮酸，一部分丙酮酸通过丙酮酸脱羧酶转化为乙醛，在厌氧条件下生产乙醇。乙醇脱氢酶E (alcohol dehydrogenase E,adhE)是一种双功能的醇醛脱氢酶，负责催化乙醇形成过程中的两个关键步骤：将乙酰辅酶A还原为乙醛(ALDH)和乙醛还原为乙醇(ADH),同时两个还原的烟酰胺辅助因子(NADH和NADPH)作为电子供体[9]。AdhE由N端的乙醛脱氢酶与C端的乙醇脱氢酶两个结构域组成。N端的结构域负责将乙酰辅酶A还原为乙醛，而C端的结构域负责将乙醛还原为乙醇[10,11]。adhE对于细菌乙醇产生的重要性在许多细菌中已有实验证实，如热纤梭菌、热解糖高温厌氧杆菌等[12]。然而，adhE是否影响HiAlc Kpn菌株的乙醇产量依然未知。

HiAlc Kpn TH1为课题组前期分离的高产乙醇肺炎克雷伯菌株，该菌株能够以葡萄糖、果糖等多种糖类为底物，发酵代谢产生大量乙醇，其产乙醇能力远高于同属肠杆菌科的大肠杆菌。本研究以HiAlc Kpn TH1为背景研究菌株，采用温敏型质粒介导的同源重组技术对基因adhE进行无痕敲除，通过测定生长曲线研究基因adhE缺失对HiAlc Kpn的生长速率影响，通过测定乙醇脱氢酶活性与乙醇产量明确adhE对HiAlc Kpn乙醇产量的影响。研究结果将加深对HiAlc Kpn产乙醇机制的认识。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验菌株

菌株HiAlc Kpn TH1来源为课题组前期从自酿酒综合征合并非酒精性脂肪肝病人肠道分离所得，其基因组序列参考NCBI Reference Sequence: NZ_CP016159.1。ΔadhE缺失菌株是以HiAlc Kpn TH1野生型菌株为背景敲除基因adhE所得。回补菌株是在以ΔadhE缺失菌株为背景，过表达pGEM-Teasy-adhE质粒所得。所有菌株均可在LB肉汤培养基(北京陆桥技术股份有限公司，目录号为CM158)中培养。测定乙醇含量的培养基，需在普通LB培养基中添加2%的葡萄糖。

1.1.2实验试剂

DNA纯化试剂盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(目录号：DC301-01)、基因组提取试剂盒FastPure® Blood/Cell/Tissue/Bacteria DNA Isolation Mini Kit(目录号：DC112-01)、质粒提取试剂盒FastPure Plasmid Mini Kit(目录号：DC201-01)以及一步克隆试剂盒ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit(目录号：C112-02)均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；限制性内切酶NotI(目录号：1623)、SalI(目录号：1636)与SphI(目录号：1632)均购自中国宝日医生物技术有限公司；乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，目录号为BC1080。

1.1.3实验引物

基因敲除及回补等分子操纵所涉及的引物通过Primer premier 5软件设计并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。相关引物序列信息见表1。

表1本研究所用的引物序列

1.2方法

1.2.1ΔadhE缺失菌株构建

通过基因组提取试剂盒提取HiAlc Kpn TH1菌株的基因组DNA。以该基因组DNA为模板，使用引物Ko-adhE-upF/Ko-adhE-upR和Ko-adhE-dnF/Ko-adhE-dnR进行PCR分别获取基因adhE的上游同源臂与下游同源臂。随后使用引物Ko-adhE-upF与Ko-adhE-dnR进行PCR获取adhE的上下游同源臂融合片段，并使用DNA纯化试剂盒对PCR产物进行DNA产物纯化。提取质粒pKO3并使用限制性内切酶NotI对质粒进行酶切，随后进行DNA产物纯化的回收步骤。采用一步克隆试剂盒将adhE的上下游同源臂融合片段与经限制性内切酶NotI酶切后的质粒pKO3进行连接，使用引物Ko-adhE-upF与Ko-adhE-dnR进行PCR筛选正确的敲除质粒菌株。随后将基因adhE的敲除质粒电转化到菌株HiAlc Kpn TH1的感受态细胞中，在37、42℃的条件下依次培养电转化菌株，在浓度为7.5%的蔗糖平板上筛选正确的基因adhE缺失菌株。

1.2.2回补菌株构建

用于构建回补菌株的质粒pGEM-Teasy通过质粒提取试剂盒进行提取，并使用限制性内切酶SalI与限制性内切酶SphI对质粒进行双酶切，随后使用DNA产物纯化试剂盒对双酶切产物进行产物纯化。以HiAlc Kpn TH1的基因组为模板，使用引物adhE-F与adhE-R进行PCR获取adhE基因的表达片段。使用一步克隆试剂盒将adhE的表达片段与经限制性内切酶双酶切后的质粒pGEM-Teasy进行连接，通过引物Teasy-F与Teasy-R筛选正确的回补基因adhE的重组质粒，并将其电转化到ΔadhE基因缺失菌株中，获得基因adhE的回补菌株。并将pGEM-Teasy空质粒电转化到野生型菌株HiAlc Kpn TH1与ΔadhE基因缺失菌株中获得对照菌株。

1.2.3细菌的生长曲线测定

首先将冻存于-80℃冰箱的野生型菌株HiAlc Kpn TH1,ΔadhE基因缺失菌株及回补菌株在LB平板划线复苏，挑取单菌落于3 mL LB液体培养基中37℃过夜培养。随后以1∶100的比例将过夜菌株转接到20 mL新鲜的液体LB培养基中，每间隔2 h通过可见光分光光度计测定菌液600 nm处的吸光度(OD600 nm)数值，待菌株生长进入平台期停止测定。使用软件Graphpad绘制菌株生长曲线。

1.2.4乙醇脱氢酶活性测定

使用乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒对各菌株的乙醇脱氢酶活性进行检测。具体操作方法可参照说明书，简要步骤如下：约取500万细胞数量加入1 mL提取液，冰浴超声破碎细胞(功率300 W,超声3 s,间隔7 s,总时间3 min),随后4℃条件下16 000 g离心20 min,取上清液置于冰上待检测。分光光度计预热30 min,调节波长到340 nm,使用蒸馏水进行调零，同时将试剂盒中的试剂一在25℃水浴中保温15 min以上，按照试剂盒说明书分别配置空白管与测定管，并在15、75 s时测定340 nm的吸光值。最终按照细胞数量计算ADH活性。活性单位定义为25℃中每104个细胞每min氧化1μmol NADH为1个酶活单位。

1.2.5乙醇产量测定

为测定菌株的乙醇产量，首先将冻存于-80℃冰箱的野生型菌株HiAlc Kpn TH1,ΔadhE基因缺失菌株及回补菌株在LB平板划线复苏，挑取单菌落于3 mL LB液体培养基中37℃过夜培养，隔天将各菌株以1∶100的比例转接于3 mL液体LB培养基(含2%葡萄糖)中，37℃过夜厌氧条件培养16～20 h,首先取1 mL菌液检测600 nm处的吸光度，OD600 nm数值可间接反映菌的数量多少。同时再取1.5 mL菌液12 000 r/min的转速离心2 min,取上清溶液并使用顶空法检测乙醇含量。由于adhE基因缺失会影响菌株生长速度，所测得菌株的乙醇含量数值除以菌株各自的OD600 nm数值，即“每OD600 nm的乙醇含量”用于比较不同菌株的产乙醇能力。

1.3统计学分析

实验数据通过GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析，符合正态分布结果用均数±标准差

表示，正态且方差齐多组间比较采用One-way ANOVA检验，进一步两组间差异比较采用Tukey法。P<0.05代表差异具有统计学意义。

2、结果

2.1ΔadhE缺失株鉴定结果

基因adhE全长2 676 bp,本研究试图将adhE基因内部2 577 bp区域缺失，使用引物Ko-adhE-F与Ko-adhE-R对蔗糖平板上的单菌落进行PCR验证，野生株得到2 867 bp大小的PCR扩增片段，成功的ΔadhE基因缺失菌株得到290 bp大小的PCR扩增片段，并将ΔadhE基因缺失菌株的PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过序列比对再次确认adhE基因被成功敲除(图1)。

图1高产乙醇肺炎克雷伯菌ΔadhE基因缺失菌株的鉴定 

2.2回补菌株鉴定

将构建成功的回补质粒pGEM-Teasy-adhE电转到ΔadhE基因缺失菌株中，同时将pGEM-Teasy空质粒电转到野生型菌株HiAlc Kpn TH1与ΔadhE基因缺失菌株中获得对照菌株。采用引物Teasy-F与Teasy-R对菌株进行PCR验证，若PCR结果为194 bp大小片段，则菌株中含有pGEM-Teasy空质粒。若PCR结果为3 061 bp大小片段，则菌株为含有pGEM-Teasy-adhE质粒的回补菌株(图2)。

图2回补菌株的鉴定  

2.3ΔadhE缺失菌株的生长曲线

通过在LB液体培养基中测定菌株的生长曲线发现，ΔadhE基因缺失菌株的生长速度显著降低，表明基因adhE对于HiAlc Kpn菌株生长的重要性。同时回补菌株的生长速度接近野生型菌株(图3)。

图3ΔadhE基因缺失菌株的生长曲线

2.4ΔadhE缺失株的乙醇脱氢酶活性测定

通过测定含2%葡萄糖LB培养基中菌株的乙醇脱氢酶活性可以观察到，相比于野生型菌株TH1,ΔadhE缺失菌株的乙醇脱氢酶活性显著降低(P<0.001)。而回补菌株的乙醇脱氢酶活性显著高于ΔadhE缺失菌株(P<0.001)。由于使用高拷贝质粒进行adhE基因回补的原因，回补菌株的乙醇脱氢酶活性同样显著高于只有一个adhE基因拷贝数的野生型菌株(P=0.003 9,图4)。

图4ΔadhE基因缺失菌株的乙醇脱氢酶活性  

2.5ΔadhE缺失株的乙醇产量测定

考虑到adhE的缺失会影响菌株的生长速度，因此使用“每OD600 nm的乙醇产量”来比较不同菌株的产乙醇能力。如图5所示，ΔadhE缺失菌株的乙醇产量显著低于野生型菌株TH1(P<0.001)。而回补菌株的乙醇产量显著高于ΔadhE缺失菌株(P<0.001)。野生型菌株TH1与回补菌株之间的乙醇产量无统计学差异(P=0.341 11)。

图5ΔadhE基因缺失菌株的乙醇产量

3、讨论

一直以来，乙醇作为肠道细菌的代谢产物之一，并未受到足够的重视。自酿酒综合征是一种罕见病，病人发病是在食用了碳水化合物或可乐等饮料后几小时，血液中的酒精含量能够急剧上升，浓度高达4～5 g/L,远高于法律规定的醉驾标准(0.8 g/L)[5]。课题组前期报告了国际上首例自酿酒综合症合并非酒精性脂肪肝炎病人，并发现存在于病人肠道内的HiAlc Kpn能够通过代谢葡萄糖等碳源产生大量内源性乙醇，是导致NAFLD的新病因[5]。HiAlc Kpn与大肠杆菌同属于肠杆菌科，而前者的乙醇产量却是后者的数倍。虽然抗生素是治疗细菌感染的有效手段，但随着细菌耐药性的不断增强，亟需新的治疗手段替代传统抗生素治疗。双功能的乙醇/乙醛脱氢酶AdhE在大肠杆菌中已经被研究的较为清楚，其对细菌的乙醇产生至关重要[13]。研究AdhE对HiAlc Kpn菌株产乙醇能力的影响，将有助于判断基因adhE是否为潜在的药物靶点，能够用来抑制HiAlc Kpn的乙醇产生，进而为治疗由HiAlc Kpn导致的非酒精性脂肪肝疾病提供新的治疗策略。

本研究采用基于温敏质粒介导的同源重组方法对HiAlc Kpn TH1的基因adhE进行了无痕敲除。生长曲线的测定表明在厌氧条件下，基因adhE对于菌株HiAlc Kpn TH1的生长至关重要，进一步通过检测菌株的乙醇脱氢酶活性与乙醇产量，证明adhE是菌株HiAlc Kpn TH1产乙醇的重要代谢基因。现有研究数据充分表明基因adhE是一个有潜力的药物靶点，抑制adhE的功能，就有可能降低HiAlc Kpn的乙醇产量。本研究中，未结合小鼠NAFLD动物模型验证ΔadhE基因缺失菌株对小鼠NAFLD症状的影响。未来的工作中，将在明确基因adhE缺失对菌株毒力及小鼠NAFLD症状影响的基础上，寻找基因adhE的抑制剂或以基因adhE的核酸序列设计肽核酸PNA分子，尝试探索以基因adhE为药物靶点的新型治疗药物或手段[14,15]。

综上所述，本研究明确了双功能乙醛/乙醇脱氢酶AdhE对于高产乙醇肺炎克雷伯菌株HiAlc Kpn产乙醇能力的影响，为治疗由HiAlc Kpn引起的非酒精性脂肪肝病提供了潜在的药物靶点。

参考文献:

[3]廖全凤,袁余,张为利,等.血流感染碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因和毒力基因及分子流行病学研究[J].四川大学学报(医学版),2024,55(2):391-396.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(NO:32200159);

文章来源:范政,付彤彤,陈雨晨,等.高产乙醇肺炎克雷伯adhE缺失菌株构建及对其产乙醇能力的影响[J].遵义医科大学学报,2024,47(05):442-446+453.