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内质网应激在消癌解毒方在人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用

2020-06-16 480 上传者：管理员

摘要：[目的]探讨内质网应激在消癌解毒方在人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用。[方法]CCK-8法检测不同浓度的消癌解毒方处理HepG2细胞12、24、48h后细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测细胞消癌解毒方处理HepG2细胞24h凋亡情况;应用qRT-PCR检测内质网应激上游分子标记GRP78、PERK、ATF-6、IRE-1的mRNA水平;采用Westernblot方法分析消癌解毒方对PERK、ATF4、CHOP和TRB3蛋白的表达情况;并用CCK-8法检测内质网抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)对HepG2细胞凋亡率的影响。[结果]消癌解毒方抑制HepG2细胞的增殖,并且这种效应呈现时间和浓度依赖;ATF-6和IRE-1mRNA水平无明显变化,GRP78和PERKmRNA水平较阴性对照组均显著增加;消癌解毒方可上调内质网应激通路的标志蛋白质PERK、ATF4、CHOP水平,增加下游TRB3蛋白的表达。4-PBA与消癌解毒方联合作用组的细胞凋亡率显著减少。[结论]消癌解毒方通过内质网应激诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,其可能是通过PERK通路上调内质网应激相关凋亡蛋白CHOP的表达。

关键词：
内质网应激
消癌解毒方
细胞凋亡
肝细胞癌
肿瘤
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肝癌是恶性程度很高的消化系统肿瘤,其分为肝细胞癌、胆管细胞癌和混合细胞癌,其中肝细胞癌最为常见[1]。根治性手术是治疗肝癌的首选方法,但对晚期患者的疗效不佳,放化疗等方法对生存期以及生存质量的改善同样十分有限[2]。消癌解毒方由国医大师周仲英教授根据其“癌毒”理论创立,是治疗恶性肿瘤的基本验方,临床使用多年,疗效显著[3]。已有文献报道,消癌解毒方在不同层面通过调控PI3K/AKT、p53、TGF-β、TLRs/NF-κB、IL6/STAT3、Survivin、VEGF、MMP-2信号的表达,抑制包括肝癌在内的多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡[4,5,6,7]。然而,消癌解毒方是否能够通过内质网应激调控肝癌细胞凋亡,目前尚未有文献报道。本文拟探讨消癌解毒方与肝癌HepG2细胞凋亡的关系,并研究ERS在其中发挥的作用,寻找消癌解毒方诱导肝癌细胞凋亡中发挥关键作用的ERS蛋白,以期在此基础上探索新的治疗靶点。

1、材料与方法

1.1药品与试剂

DMEM培养液、FBS胎牛血清、CCK-8试剂盒、4-苯基丁酸(4-phenylbutyricacid,4-PBA)、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、总RNA提取试剂盒、PrimeScriptRTreagentKit、SYBRPremixExTaqⅡ试剂盒、SDS上样缓冲液、BCA试剂盒、β-actin、GRP78、ATF-6、PERK及IRE-1引物设计及合成由公司完成;β-actin抗体、PERK抗体、ATF4抗体、CHOP抗体、TRB3抗体一抗,兔二抗及鼠二抗。

1.2细胞培养及动物

人肝癌HepG2细胞株保存于本实验室。HepG2细胞培养液:含10%FBS的DMEM培养液中;培养环境:37℃、5%CO2。待细胞贴壁生长至约80%融合时,进行传代或实验。清洁级雄性新西兰兔,体重2.0～2.2kg。

1.3含药血清制备

消癌解毒方由白花蛇舌草、山慈姑、麦冬、太子参、半枝莲、莪术等中药按比例组成,由南京中医药大学附属医院煎药室煎制、浓缩(生药含量为2g/mL),保存备用。将动物随机分为4组:消癌解毒方低剂量组,给药剂量3.78g/kg(相当于临床等效量);消癌解毒方中剂量组,给药剂量7.56g/kg;消癌解毒方高剂量组,给药剂量15.12g/kg;对照组,给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃。每组4只,每日8∶00及20∶00分别给药2次,连续给药3d,末次给药前12h禁食不禁水,末次给药2h后颈动脉分离取血,血液静置30min后,3000r/min离心5min,取血清56℃水浴30min灭活,于超净工作台中用0.22μm微孔滤膜过滤除菌,分装后,置于—80℃冰箱保存备用。

1.4CCK-8法检测HepG2细胞增殖

收集对数期HepG2细胞,调整细胞浓度为6×104/mL,每孔100μL接种于96孔板。37℃、5%CO2条件下孵育,待细胞生长至60%～70%汇合时,加入含不同浓度(空白组、低、中、高剂量组)消癌解毒方的血清(另设等量加入培养液对照组),每组另设2复孔,分别于孵育12、24、48h后,吸弃含药培养液,新鲜培养液与CCK-8按100∶1的比例混匀后每孔加入100μL,继续孵育1h后放于酶标仪上检测(波长为450nm)各孔吸收度值,计算细胞增殖率[8]。

1.5流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率

收集对数期细胞,接种于96孔板,37℃、5%CO2条件下孵育,待细胞生长至80%汇合时,加入消癌解毒方血清,孵育24h后,吸弃含药培养液,PBS洗涤后加入胰酶消化,转移到1.5mL离心管内,1000r/min离心5min,弃上清;用结合缓冲液轻轻重悬细胞至细胞密度为1×106/mL,移液100μL的细胞悬液到1.5mL离心管中,加入5μLAnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶染色液,避光孵育15min,后再加入400μL的结合缓冲液,1h内用流式细胞仪检测量细胞凋亡率,实验重复3次[9]。

1.6qRT-PCR

使用总RNA提取试剂提取细胞RNA,并使用逆转录试剂盒PrimeScriptTMRTreagentKit进行逆转录,制备cDNA,各cDNA样品分别用下列引物进行qRT-PCR反应;反应体系为:Mix水6.25μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、灭菌双蒸水4.25μL、cDNA1μL,体系为12.5μL;反应条件为:95℃预变性3min;95℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸30s,循环40次[10]。引物序列见下表。使用ΔΔCq法进行统计分析。

1.7Westernblot

收集对数期细胞,接种于96孔板,37℃、5%CO2条件下孵育,待细胞生长至80%汇合时,加入中等剂量含消癌解毒方的血清,孵育24h后,吸弃含药培养液;冰上操作,PBS洗涤2遍,每孔加入约100μL1:1000蛋白裂解液,摇匀,置冰上10min后将溶液收集于离心管中;冰上操作,使用超声波进行裂解3次,每次3s,间隔1s,4℃13000r/min离心5min后收集上清;BCA试剂盒进行蛋白质定量,调整蛋白浓度,使其保持一致;每4μL蛋白质样品加入1μLSDS缓冲液,煮沸5min,配置成为上样液,-20℃保存;上样后,使用8%的SDS-PAGE电泳,转膜至PVDF,5%的脱脂奶粉封闭1h,β-actin、PERK、ATF4、CHOP及TRB3一抗,1∶400稀释后,4℃孵育过夜,TBST清洗后使用相应二抗室温孵育1h,TBST清洗后显影液显影、拍照[10]。

1.8CCK8测定内质网抑制剂4-PBA对HepG2细胞增殖的影响

收集对数期细胞,调整细胞浓度为6×104/mL,接种于96孔板,每孔100μL,37℃5%CO2条件下孵育,待细胞生长至80%融合时,对照组:加入等量培养液2h后加入不含药血清;4-PBA组:20mmol/L的4-PBA预处理2h后加入不含药血清;消癌解毒方组:加入等量培养液2h后加入中等剂量含消癌解毒方血清;消癌解毒方+4-PBA组:20mmol/L的4-PBA预处理2h后加入中等剂量含消癌解毒方血清。每组另设2复孔,孵育24h后,吸弃含药培养液,新鲜培养液与CCK-8按100∶1的比例混匀后每孔加入100μL,继续孵育1h后放于酶标仪上检测450nm各孔吸收度(A)值,计算细胞增殖率[8]。

1.9统计学处理

所有数据均以x±s表示,使用SPSS19.0软件进行数据处理及分析。统计方法为单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。使用GraphpadPrism7.0软件绘制图形。

2、结果

2.1消癌解毒方抑制HepG2细胞增殖活性

不同浓度消癌解毒方分别处理HepG2细胞12、24、48h,采用CCK-8法检测各组细胞活力。结果显示,消癌解毒方处理后,HepG2细胞生长受到不同程度的抑制,中、高剂量组对HepG2细胞抑制作用较强,消癌解毒方在24h后其抑制作用较前有所减弱,见图1。根据抑制曲线,本研究选取中剂量消癌解毒方作用24h进行后续实验。

图1消癌解毒方抑制HepG2细胞增殖

图2消癌解毒方诱导HepG2细胞凋亡

2.3消癌解毒方对HepG2细胞GRP78、ATF-6、IRE-1mRNA水平的影响

经中等剂量消癌解毒方处理24h后,提取HepG2细胞中的mRNA,检测ERS相关分子GRP78、ATF-6、IRE-1、RERK的mRNA水平。结果显示,GRP78和PERK水平显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),而ATF-6、IRE-1升高不显著,见图3。

图3消癌解毒方作用后内质网应激相关分子的mRNA表达

2.4消癌解毒方对HepG2细胞内质网应激相关蛋白质水平的影响

根据2.3结果,处于ERS上游的3条通路中仅有GRP78和PERKmRNA水平增加。因此,使用Westernblot进一步检测PERK通路的相关蛋白的表达情况。在中等剂量含消癌解毒方血清干预后,实验组PERK及其下游的ATF4、CHOP、TRB3蛋白水平均显著升高,提示消癌解毒方可活化ERS中PERK通路,增加其下游相关凋亡蛋白的表达,见图4。

图4消癌解毒方对ERS相关蛋白的影响

2.5内质网抑制剂4-PBA对HepG2细胞凋亡的影响

根据1.8中的实验分组及细胞处理方法,我们采用CCK8法测定了4组细胞的凋亡情况。与对照组比较,仅加入内质网抑制剂4-PBA后,细胞凋亡无明显变化,提示内质网抑制剂4-PBA对细胞凋亡无影响;消癌解毒方组和消癌解毒方+4-PBA组的细胞凋亡率均显著增加(P<0.05);消癌解毒方组与消癌解毒方+4-PBA组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5内质网抑制剂4-PBA对消癌解毒方诱导的HepG2细胞凋亡的影响

3、讨论

“癌毒”理论是国医大师周仲英教授在中医经典理论指导下,加以其近六十年临床经验总结提出。周老认为恶性肿瘤证候复杂、易于流结、预后较差,其根本原因在于肿瘤发生时,机体脏腑功能失调、气血阴阳紊乱,正气虚弱,火郁、热毒、痰聚、湿浊等癌毒侵袭人体,进一步耗伤气血阴阳,痰浊湿聚,兼夹为病。“癌毒郁结、阴伤气耗”是导致恶性肿瘤发生、发展的重要因素[11]。根据“癌毒”理论,周老进一步创立了治疗恶性肿瘤的抗癌解毒大法,将“消癌解毒,扶正祛邪”贯穿于肿瘤治疗的始终。消癌解毒方正是在此理论指导下,通过数十年临床验证形成的治疗恶性肿瘤的有效验方。该方由白花蛇舌草、山慈姑、麦冬、太子参、半枝莲、莪术等中药按比例组成,全方扶正祛邪,攻补兼施,在临床应用多年,证实对肝癌等恶性肿瘤疗效明确[12]。

ERS是指由于细胞内外环境变化引起的错误折叠以及未折叠的蛋白质在内质内的聚集以及Ca2+平衡的失调。多项研究表明,ERS在肝细胞癌的发生发展过程中起着关键性作用[13,14]。当ERS发生时,积聚的蛋白质使GRP78与ERS3个感受器蛋白PERK、IRE-1、ATF6解离,在转录和翻译水平分别介导3条不同的信号通路[15]。研究显示,PERK通路激活后,其下游的ATF4-CHOP活化[16]。CHOP是ERS特异的转录因子,在ERS诱导细胞凋亡中发挥促凋亡作用[17]。课题组前期研究同时表明,CHOP可促进肝癌细胞MHCC-97H凋亡,其具体机制可能是通过与TRB3相互调节,TRB3进一步增加AKT磷酸化,激活下游mTOR[10]。

本研究结果表明,在消癌解毒方作用下,肝癌细胞HepG2的增殖明显被抑制作用,且与药物的浓度及作用时间存在相关性。同时,流式细胞术发现消癌解毒方引起的细胞死亡中,细胞凋亡占据了绝大比例。在此基础上,本研究进一步采用qRT-PCR技术检测ERS3种感受蛋白质,发现仅PERKmRNA水平显著上调,而IRE1mRNA及ATF6mRNA水平均无改变,其原因可能是消癌解毒方在诱导肝癌细胞HepG2凋亡时,主要是通过PERK途径。因此,本文进一步研究了PERK途径的相关因子的表达。用消癌解毒方作用后,PERK通路相关信号分子ATF4、CHOP及TRB3蛋白表达均上调,进一步验证了qRT-PCR结果。4-PBA是一种低分子游离脂肪酸,可以稳定蛋白质合成,抑制内质网应激,恢复细胞内环境稳态[18]。为了进一步验证ERS在消癌解毒方诱导HepG2细胞凋亡中的作用,我们采用4-PBA预处理细胞,结果发现4-PBA可抑制由消癌解毒方诱导的HepG2细胞凋亡,减弱了ERS对细胞的凋亡作用,从而导致细胞凋亡率降低。

消癌解毒方可通过内质网应激诱导人肝癌HepG2细胞的凋亡,其可能是通过PERK通路上调内质网应激相关凋亡蛋白ATF4、CHOP、TRB3的表达。然而,细胞凋亡的机制十分复杂,本研究仅初步探讨了ERS在消癌解毒方诱导HepG2细胞凋亡中的作用,消癌解毒方诱导肿瘤细胞凋亡的具体机制还需更加全面深入的探究。

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