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WRAP53与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征及预后的关系

2023-12-07 173 上传者：管理员

摘要：目的:探讨端粒酶新核心亚单位(WD40-encoding RNA antisense to p53,WRAP53)又名端粒酶卡哈尔体蛋白1(telomerase cajal body protein 1,TCAB1)在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)组织中的表达，分析其与患者临床病理特征及预后的关系。方法:收集28例PTC患者的癌及癌周正常新鲜组织标本，应用实时荧光定量聚合酶链反应法(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPR-PCR)及免疫组织化学法分别检测WRAP53 mRNA及蛋白在PTC及周围正常组织中的表达，收集117例PTC术后患者的临床数据及对应的癌组织的石蜡切片进行免疫组化检测，分析其蛋白表达水平与甲状腺乳头状癌患者的临床病理特征的相关性，最后应用蛋白质表达图谱(The Human Protein Atlas, HPA)数据库探究WRAP53与PTC预后之间的关系。结果:qPR-PCR及免疫组化结果提示WRAP53在PTC中较正常组织高表达(P<0.05)。与WRAP53低表达的PTC患者相比，WRAP53高表达的PTC患者肿瘤直径更长，更易出现淋巴结转移(P<0.05)。HPA数据库显示WRAP53高表达的PTC患者的生存率差于WRAP53低表达的PTC患者(P=0.041)。结论:通过本次研究表明，WRAP53在PTC组织中表达较周围正常组织升高，且其高表达与PTC增殖、淋巴结转移及不良预后相关。WRAP53可能是治疗PTC新的潜在靶点。

关键词：
TCAB1
WRAP53
临床病理
甲状腺乳头状癌
预后
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甲状腺癌(thyroid carcinoma, TC)是一种起源于甲状腺滤泡上皮或滤泡旁上皮细胞的恶性肿瘤，是最常见的内分泌恶性肿瘤[1,2],发病率在全球范围内呈上升趋势[3],中国甲状腺癌发病率以每年20.1%的速度增长[4]。其中甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)占所有TC的85%～90%[5,6] 。PTC发病机制至今仍不明确。早期PTC的死亡率相当低，但是若肿瘤进展为晚期，患者常因肿瘤多器官转移而死亡。因此，对PTC发病机制的深入研究以及寻找潜在的靶点对临床诊断具有重要的指导意义。端粒酶新核心亚单位(WD40-encoding RNA antisense to p53,WRAP53)又名端粒酶卡哈尔体蛋白1(telomerase cajal body protein 1,TCAB1)是2009年新发现的端粒酶关键核心蛋白组分，对端粒酶定位、端粒组装、Cajal体完整性和DNA双链断裂修复起着重要作用[7,8,9,10,11]。研究显示WRAP53在多种肿瘤中呈高表达状态，具有促进肿瘤发生发展的作用[12,13],其高表达与食管癌及肺癌预后不良有关[14,15],但在卵巢癌预后研究中，得出不一致的结论，认为 WRAP53表达缺失提示预后不良[16]。在行放疗的直肠癌患者中，观察到WRAP53高表达患者预后更好[17],可见WRAP53表达在不同肿瘤中的预后预测作用不统一。WRAP53在PTC中表达情况及其与PTC患者的预后关系目前未知。为了进一步了解WRAP53与 PTC的关系，我们探讨了 WRAP53在PTC组织中的表达，分析其与PTC患者的临床病理特征关系，探讨WRAP53表达与PTC患者预后的关系，期望为早期发现PTC发生、发展及预测PTC预后作出贡献。

1、资料与方法

1.1 病例资料

本研究所用的组织及临床数据均来自于我院，先收集28例患者的甲状腺乳头状癌及周围正常的新鲜组织(距离癌组织最远处进行取材，距离≥1 cm, 未被肿瘤组织浸润),取材大小约0.5 cm×0.5 cm, 在手术室中切除后迅速用液氮冷冻，用于qRT-PCR,收集对应病理号患者的肿瘤及周围正常组织的石蜡切片进行免疫组化。再收集117例甲状腺乳头状癌患者的临床病理资料，包括年龄、性别、是否淋巴结转移、肿瘤直径大小及病灶数量，同时于病理科收集相应患者的石蜡切片用于免疫组织化学法检测，分析WRAP53蛋白表达与患者临床病理特征的关系。该研究通过海南医学院第二附属医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂

WRAP53抗体(ab99376)购自英国Abcam公司；DAB染色液(增强聚合物法)试剂盒、EDTA抗原修复液购自福州迈新有限公司；TRIzol购自上海Invitrogen公司，逆转录试剂盒(Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR)和实时荧光定量聚合酶链反应法(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPR-PCR)试剂盒(Hieff qPCR SYBR Green Master Mix)购自YeasonBiotechnology(上海)。

1.3 方法

1.3.1 qPR-PCR检测WRAP53 mRNA

实验流程根据qPR-PCR试剂盒相关说明进行，其中WRAP53引物上游序列为GCTGTAAGTGGGCTCCTGA,下游序列为GGCTGGGCTGAGGACAT。

1.3.2 免疫组织化学法检测WRAP53蛋白

收集就诊于我院乳甲外科的117例PTC患者的临床病理资料，同时于病理科收集相应患者的石蜡切片用于免疫组织化学法检测，分析WRAP53蛋白表达与PTC患者临床病理特征的关系。厚度约3 μm, 烤干、脱蜡、脱水、冲洗，EDTA修复抗原，按照 DAB染色液(增强聚合物法)试剂盒说明书，依次添加过氧化物酶阻断剂、WRAP53一抗(浓度1∶100)、反应增强液、酶标抗兔 IgG聚合物、DAB显色、复染、二甲苯透明、封片。最后由2位病理科医师采用双盲法进行读片，免疫组化结果判读标准参考文献[14],最终WRAP53分为高表达及低表达两组。

1.3.3 HPA数据库分析WRAP53表达与PTC预后的关系

蛋白质表达图谱(The Human Protein Atlas, HPA)数据库是基于RNA测序和免疫组化分析的大型转录组及蛋白组的数据库，本研究运用此数据库分析WRAP53表达情况与PTC患者预后的关系。

1.4 统计学处理

应用R语言软件对实验所有数据进行统计分析，对癌组织及癌周正常组织的WRAP53 mRNA相对表达量采用2-△△Ct计算，表达结果进行正态性检验，因数据符合正态分布故应用配对t检验进行分析。分类计量资料采用卡方检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 WRAP53在PTC及其对应癌旁正常组织中 mRNA 表达情况

收集28例确诊为PTC患者的病理及周围正常组织标本进行qPR-PCR,分析WRAP53在PTC及周围正常组织中的mRNA相对表达量，发现WRAP53 mRNA在癌中表达较正常组织高(P<0.05)(图 1)。

2.2 WRAP53在PTC及周围对应正常组织中蛋白表达水水平

收集做mRNA相应患者的PTC及癌周组织石蜡，进行切片，然后行免疫组化检测，发现WRAP53在28例患者的PTC中均高表达，主要呈棕色，而周围的正常组织的脉管为阳性表达，正常甲状腺细胞呈阴性表达(图 2)。

图1 WRAP53 在PTC组织与癌旁正常组织中表达差异(*P<0.05)

2.3 WRAP53 蛋白表达水平与PTC患者临床病理特征的关系

总共有117例PTC患者纳入分析，中位年龄44岁，根据中位年龄分为两组。行单因素卡方检验发现，WRAP53蛋白表达与年龄、性别及病灶个数无关，与淋巴结转移及肿瘤直径有关，肿瘤直径越大及有淋巴结转移的患者，WRAP53表达水平更高(卡方值分别为10.4和21.63,P<0.05),详见表1。

图2 WARP53在甲状腺乳头状癌组织中的表达

肿瘤细胞核显示黄色或者棕黄色染色(如图A箭头所示，IHC×100);WARP53在甲状腺乳头状癌组织高表达，癌周正常滤泡细胞阴性表达(红色箭头所示),癌周脉管为阳性表达(如图B黑色箭头所示，IHC×100);在甲状腺乳头状癌组织高表达(如图C箭头所示，IHC×200);在甲状腺乳头状癌组织呈低表达(如图D箭头所示，IHC×100)。

2.4 WRAP53表达水平与PTC预后的相关性

运用HPA数据库分析WRAP53表达与PTC患者预后的关系(如图3),总共504例患者纳入分析，其中377例PTC患者中WRAP53低表达，127例PTC患者WRAP53高表达，生存曲线结果表明与WRAP53低表达的PTC患者相比，WRAP53高表达的PTC患者生存率明显降低，差异有统计学意义(P=0.041)。

表1 不同 WRAP53蛋白表达水平与PTC临床病理特征的比较n(%)

图3 WRAP53表达与PTC患者预后关系

3、讨论

甲状腺癌作为最常见的内分泌系统恶性肿瘤，包括乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌、未分化癌等多种病理类型，最常见的为PTC 。虽然PTC恶性程度低，但容易存在出现淋巴结转移等不良生物学行为，依然对患者的预后及生活质量产生不利的影响。寻找能预测PTC侵袭转移及预后的标记物显得尤为重要。

有研究数据显示WRAP53促进肿瘤细胞生长[13,18],当WRAP53表达下调，可抑制癌肿瘤增殖并促进其凋亡[18,19]。WRAP53可能是致癌基因，促进肿瘤发生发展。WRAP53在PTC中表达及临床价值至今未见报道。本研究首先检测了配对的PTC肿瘤组织和邻近正常组织WRAP53 mRNA的表达水平，发现WRAP53 mRNA在PTC组织中的表达明显高于癌周的正常甲状腺组织。收集相应的PTC及周围正常组织的石蜡切片进行免疫组织化学法检测，同样发现WRAP53蛋白表达在PTC中高表达。我们还发现甲状腺正常滤泡细胞阴性表达，在癌周脉管中是阳性表达的，此现象进一步解释了qPR-PCR结果中正常组织仍有一定量的WRAP53 mRNA表达，同时表明WRAP53可能促进PTC的发生。有研究表明WRAP53高表达与肿瘤淋巴结转移有关[14,15],我们研究也发现WRAP53高表达与PTC淋巴结转移有关，同时还发现WRAP53表达越高，肿瘤直径越长，因此我们推测WRAP53与PTC的发展密切相关，可能是PTC治疗的潜在靶点。WRAP53促进PTC发生、发展的机制目前并不明确。在口腔鳞癌的研究中，发现WRAP53可能通过影响血管生成促进肿瘤增殖[20]。本研究发现WRAP53在PTC脉管中阳性表达，其是否通过影响血管生成促进肿瘤发生、淋巴结转移有待将来体内外实验进一步明确。WRAP53具有维持端粒酶正常功能及DNA损伤修复功能的作用[11],有学者认为WRAP53在肿瘤中的作用可能与端粒酶功能异常、DNA损伤积累及DNA修复缺陷有关[7,21],这两个途径是否参与PTC发生发展，有待将来在机制研究中进行详细探讨。

WRAP53可作为肿瘤的预后因子，在不同肿瘤中的预后预测价值不同。为了探讨WRAP53对PTC患者预后的影响，我们运用 HPA数据库分析WRAP53表达与PTC患者预后的关系(如图3),结果表明，与WRAP53低表达的PTC患者(n=377)相比，WRAP53高表达(n=127)的PTC患者生存率明显降低，提示WRAP53高表达是PTC患者不良的预后因子，分析WRAP53高表达预后差的原因可能与WRAP53高表达的PTC更容易增殖转移有关，因为本研究观察到高表达患者肿瘤直径更大及淋巴结转移比例更高。了解WRAP53表达情况将有助于预测PTC患者预后。

本研究是回顾性研究，存在固有的局限性：①样本量偏小；②可能存在选择偏倚；③没有使用正常甲状腺细胞系及动物体内成瘤实验进一步验证与之相关的调控通路；④由于PTC患者预后较好，随访时患者均存活，故采用HPA数据库患者观察不同WRAP53表达水平PTC患者生存情况，因数据库限制，患者的TSH等血液学指标及更详细的临床资料未知，故无法进行多因素COX回归分析。

通过本次研究表明，WRAP53高表达促进PTC增殖及淋巴结转移，与PTC的不良预后相关，WRAP53有望成为治疗PTC新的治疗靶点。WRAP53促进PTC发生发展的机制尚不明确，本研究发现WRAP53在脉管中表达，其是否通过影响肿瘤血管的生成促进PTC进展，我们后续将开展体内外实验进行验证。

参考文献:

[20]王琨,葛奕辰,崔博淼,等.端粒酶卡侯体蛋白1干扰慢病毒对口腔鳞状细胞癌细胞裸鼠致瘤作用的研究[J].国际口腔医学杂志,2017,44(1):32-36.

基金资助:海南省自然科学基金青年基金项目(编号:819QN364);

文章来源:戢楠楠,邓文艺,陈秀秀等.WRAP53与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征及预后的关系[J].现代肿瘤医学,2024,32(01):60-64.