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植生拉乌尔菌临床株PD201对碳青霉烯类耐药的分子机制

2025-05-04 70 上传者：管理员

摘要：目的探讨植生拉乌尔菌临床株PD201对碳青霉烯类耐药的分子机制｡方法通过全基因组测序(Wholegenomesequencing,WGS)获得PD201菌株的序列,利用在线软件分析菌株携带的耐药基因｡然后,质粒液相接合检测菌株携带的质粒特性｡结果WGS显示植生拉乌尔菌临床株PD201携带的碳青霉烯酶基因blaNDM-1和blaKPC-2位于不同的质粒上,分别命名为p201A(携带NDM-1)和p201B(携带KPC-2);质粒液相接合显示,这两个质粒除了分别传递到大肠埃希菌J53AziR外,还可重组成新的杂合质粒,命名为p201-C1(携带NDM-1+KPC-2)｡结论植生拉乌尔菌PD201株对碳青霉烯类耐药的分子机制是因为同时携带了blaNDM-1和blaKPC-2基因｡另外,这两个携带碳青霉烯酶基因的质粒既可单独,又可重组在一起进行种间的水平传播｡

关键词：
blaKPC-2
blaNDM-1
基因
碳青霉烯酶
肺炎克雷伯菌
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植生拉乌尔菌(Raoultellaplanticola)于2001年由克雷伯属归于拉乌尔属,是一种条件致病菌[1],可引起人体的血流､中枢神经系统､泌尿系统感染和肺炎及其他部位的感染[2-4]｡近几年来,由碳青霉烯类耐药植生拉乌尔菌引起人体感染的报道也逐渐增多[5]｡这些菌株多数以携带单一的碳青霉烯酶基因为主,但关于同时携带多个碳青霉烯酶基因的报道较少[6-10]｡因此,本文对1株分离自住院患者的耐碳青霉烯类的拉乌尔菌PD201进行研究,以探讨其对碳青霉烯类耐药的分子机制和评估该菌株对所携带的质粒进行基因水平转移能力,现报道如下｡

1、材料和方法

1.1临床和标准

菌株碳青霉烯类耐药的拉乌尔菌临床株PD201分离自住院患者｡作为分子量标记的沙门菌H9812和质粒液相接合受体菌(E.coliJ53AziR)为本实验室保存｡

1.2碳青霉烯酶和药敏检测

细菌药敏采用梅里埃AST-13卡(VITEK2Compact系统检测);碳青霉烯酶检测通过NG-Test○RCARBA5卡(biotech公司);按仪器和试剂盒内说明书操作｡

1.3液相接合试验和接合子的鉴定

质粒的液相接合试验和S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳(S1-PFGE)参照相关文献[7-8];PFGE系统和成像仪为美国伯乐公司生产｡

1.4菌株的全基因组测序和生物信息学分析

全基因组测序通过Illumina和Nanopore平台进行｡然后,利用软件进行生物信息分析,如Res-Finderv4.1(https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)和PlasmidFinderv2.0.1(https://cge.food.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)以及基因组注释RAST(http://RAST.nmpdr.org)等软件｡

2、结果

2.1拉乌尔菌PD201的鉴定和药敏及碳青霉烯酶的检测

拉乌尔菌PD201初始经梅里埃VITEK2Compact系统鉴定为解鸟氨酸拉乌尔菌(R.ornithinolyti-ca),但该菌的染色体序列经ANI(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)比对确定为植生拉乌尔菌(R.planticola)｡植生拉乌尔菌PD201对目前常用的抗菌药诸如头孢类､单环类､头霉素和碳青霉烯类以及喹诺酮类都耐药,并且产KPC､NDM两种酶(胶体金免疫层析法),见图1和表1｡

图1CARBA5卡检测菌株的碳青霉烯酶图

表1植生拉乌尔菌PD201和接合子及E.coliJ53AziR对常用抗菌药物的药敏结果

2.2质粒的液相接合和接合子的药敏及S1-PFGE结果

植生拉乌尔菌PD201与E.coliJ53AziR进行液相接合,获得分别携带KPC+NDM(命名为PD201-C1)､NDM(PD201-C2和PD201-C3)和KPC(PD201-C4)3种酶表型的接合子(图1)｡然后,进行S1-PFGE｡结果显示接合子PD201-C1仅仅携带一个大于300kbp的大质粒(同时产NDM和KPC酶),推测在接合过程中发生了质粒的重组,这被后来的测序结果证明｡原代菌PD201和接合子的S1-PFGE结果,见图2｡

另外,对接合子和E.coliJ53AziR进行药敏试验｡结果显示,接合子对厄他培南和亚胺培南的MIC(μg/mL)比E.coliJ53AziR分别提高16和4~16倍,这表明接合子对碳青霉烯类耐药与其产KPC和NDM酶有关｡拉乌尔菌PD201和接合子及E.coliJ53AziR对常用抗菌药物的药敏结果见表1｡

图2S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳图

2.3植生拉乌尔菌PD201和接合子的生信分析结果

利用Illumina和Nanopore测序平台获得了植生拉乌尔菌PD201和接合子(PD201-C1~PD201-C4)的染色体和质粒序列｡生信分析表明:①植生拉乌尔菌PD201携带了3个与S1-PFGE图相一致的质粒,分别命名为p201A(322418bp)､p201B(126011bp)和p201C(38884bp)｡质粒p201A和p201B分别携带了blaNDM-1和blaKPC-2基因及其他耐药基因,而质粒p201C仅仅携带了blaTEM-1B基因｡②接合子PD201-C1携带了一个命名为p201-C1(397705bp)的质粒,其大小与S1-PFGE显示的一致,且blaNDM-1和blaKPC-2都位于该质粒上,即它由质粒p201A和p201B重组形成｡③接合子PD201-C2携带了一个被命名为p201-C2(323690bp)的质粒,大小与p201A相同,也携带blaNDM-1基因｡④接合子PD201-C3携带了2个质粒,命名为p201-C3A和p201-C3B,大小和携带的基因与质粒p201A和p201C相同｡⑤接合子PD201-C4携带了一个命名为p201-C4(81442bp)的质粒,与质粒p201B(126011bp)一样,blaKPC-2和其他耐药基因位于质粒上,但接合过程中质粒变小｡以上结果表明,植生拉乌尔菌PD201携带的3个质粒都可以经液相接合传递到大肠埃希菌J53AziR,而且可以发生质粒的重组｡植生拉乌尔菌PD201和接合子的生信分析及S1-PFGE详见表2和图2｡

表2植生拉乌尔菌PD201和接合子的生信分析结果

3、讨论

碳青霉烯类由于其广谱抗菌活性和低毒性,被认为是临床治疗严重革兰氏阴性细菌感染的首选药物｡然而,它们的广泛使用导致了碳青霉烯耐药性的发展和全球传播,引起了重大的公共卫生问题｡革兰氏阴性菌的碳青霉烯类耐药主要归因于碳青霉烯类酶的产生,包括A类(KPC､GES和SME等)､B类(IMP､NDM和VIM等)和D类(OXA-48､OXA-181､OXA-232和OXA-199等)｡碳青霉烯酶基因除了少数位于染色体上外,主要位于可接合质粒上,这有利于在不同种属之间碳青霉烯酶抗性基因的水平转移｡虽然碳青霉烯酶基因经常在肠杆菌目其他属细菌中发现,但它们在拉乌尔属中的出现并不常见｡

目前,全球范围内已零星报道了耐碳青霉烯类植生拉乌尔菌的病例[9-10]｡在此,我们报道了从1例患者身上分离出携带blaNDM-1､blaKPC-2､blaDHA-1blaTEM-1B､blaOXA-1和blaPLA-5A基因的植生拉乌尔菌PD201｡全基因组测序和S1-PFGE表明该菌携带了3个被命名为p201A(322418bp)､p201B(126011bp)和p201C(38884bp)的质粒,并且碳青霉烯酶blaNDM-1和blaKPC-2基因分别位于质粒p201A和p201B上,同时也伴有多个其他抗菌药物耐药基因,这使PD201菌株具有多重耐药性｡

WGS现在被认为是了解致病菌传播的关键工具｡这项技术在确定传播途径､识别进化模式和了解抗菌药耐药性机制方面发挥着重要作用｡然而,关于植生拉乌尔菌进化和遗传变异的基因组研究非常有限｡为此,本研究将植生拉乌尔菌PD201与E.coliJ53AziR进行液相接合,并将获得的4个接合子也进行全基因组测序｡结果显示,这3个质粒既可单独传递又可以重组成一个新的杂合质粒,即blaNDM-1和blaKPC-2位于同一个质粒上｡马超越等[11]曾报道从1例患儿分离的肺炎克雷伯菌QL5株同时携带了blaNDM-1和blaKPC-2基因,并且这2个基因位于同1个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒上外｡因此,全基因组比较可以确定基因组之间的相似性和差异性,从而有助于深入了解抗菌药耐药性决定因素的进化关系和遗传变异[12]｡

综上所述,本研究获得了1株共携带blaNDM-1､blaKPC-2､blaDHA-1blaTEM-1B､blaOXA-1和blaPLA-5A基因的植生拉乌尔菌PD201的全基因组序列｡此外,接合试验和比较基因组分析显示,碳青霉烯酶基因在植生拉乌尔菌PD201与E.coliJ53AziR之间的水平传播存在多样性｡该研究为揭示植生拉乌尔菌的遗传关系和抗性模式提供了有价值的见解,也揭示了植生拉乌尔菌在不同环境中的适应性和传播方式,也突显了对耐碳青霉烯植生拉乌尔菌进行积极且持续监测的迫切需求｡

参考文献:

[2]潘娟,吴俊,叶超,等.植生拉乌尔菌致血流感染并中枢神经系统感染1例并文献复习[J].中国感染与化疗杂志,2022,22(5):583-588.

[7]刘艳飞.碳青霉烯类耐药克雷伯菌血流感染分离株的耐药基因和毒力基因及同源性研究[D].青岛:青岛大学,2023.

[8]王笑,王晓慧,姜美妍,等.同时携带blaNDM-1和blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌的研究[J].中国实验诊断学,2023,27(3):279-283.

[11]马超越,王笑,刘真真,等.ST11肺炎克雷伯菌QL5株携带的质粒pQL5-NDM-KPC的研究[J].中国实验诊断学,2024,28(4):401-404.

文章来源:姜美妍,王晓慧,刘真真,等.植生拉乌尔菌临床株PD201对碳青霉烯类耐药的分子机制[J].中国实验诊断学,2025,29(04):456-459.