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分析讨论苯磺顺阿曲库铵细菌内毒素检查法

2020-07-21 486 上传者：管理员

摘要：目的:建立苯磺顺阿曲库铵细菌内毒素的常规检测方法。方法:按《中国药典》2015年版通则1143细菌内毒素检查法进行，采用不同厂家的鲎试剂对不同批号的苯磺顺阿曲库铵分别进行干扰试验。结果:在验证条件下，供试品用稀释剂Ⅰ溶解制备成5 mg•m L-1，并用稀释剂Ⅰ稀释40倍至0. 125 mg•m L-1后再用BET水稀释2倍至0. 062 5 mg•m L-1，对细菌内毒素检查法无干扰作用。结论:建立的方法用于检查苯磺顺阿曲库铵的细菌内毒素可行。

关键词：
凝胶法
干扰试验
细菌内毒素
苯磺顺阿曲库铵
药品质量
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苯磺顺阿曲库铵属于一种新型苄异喹啉类中效非去极化肌松药，是一种高度选择性、短效非去极化的神经-肌肉接头阻断剂[1,2,3]。苯磺顺阿曲库铵对细菌内毒素检查有抑制作用，会螯合鲎试剂中的二价阳离子，导致鲎试剂中的二价阳离子浓度不足，对细菌内毒素与鲎试剂的反应造成干扰。加入适量的二价金属离子(Mg2+)，来消除苯磺顺阿曲库铵对内毒素检查的干扰作用[4]。按照《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版通则1143细菌内毒素检查法对苯磺顺阿曲库铵进行细菌内毒素检查法的研究，为建立该品种的细菌内毒素检查法提供科学依据。

1、材料

1.1仪器

TAL-40D型干式恒温器(湛江安度斯生物有限公司);IKA MS3型自动漩涡混合器(广州仪科实验室技术有限公司);FED400型干燥箱(德国宾德公司);XSE205DU型电子天平(梅特勒-托利多公司);其他器皿包括试管、微量移液器及微量移液器配套的枪头(无热原)等。

1.2药品与试剂

苯磺顺阿曲库铵(Sicor Societa'Ltaliana Corticosteroidi S.R.L，批号321845-1812001、321845-1812002、321845-1812003);鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司，0.25 EU·m L-1，批号1810243;0.125 EU·m L-1，批号1811261;福州新北生化工业有限公司，0.25 EU·m L-1，批号18040712;0.125 EU·m L-1，批号18090512;规格0.1 m L/支);细菌内毒素工作标准品(中国食品药品检定研究院，批号150601-201885，规格80 EU/支;批号150800-201601，规格9000 EU/支);细菌内毒素检查用水(Water for Bacterial Endotoxins Test，以下简称BET水)，湛江安度斯生物有限公司，批号1812140，规格50 m L/瓶);稀释剂Ⅰ(江安度斯生物有限公司，批号1805240，规格4 m L/支)。

2、方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度复核试验

根据4批鲎试剂灵敏度的标示值(λ)，将细菌内毒素工作标准品用BET水溶解，置漩涡混合器上混匀15 min，然后制成浓度为2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在漩涡混合器上混合30 s，阴性对照管(Negative control,NC)，按《中国药典》2015年版通则1143细菌内毒素检查法复核本试验所用鲎试剂的灵敏度，结果4批鲎试剂灵敏度的测定值(λc)均在0.5～2.0λ范围内，符合《中国药典》规定，可用于细菌内毒素检查，详见表1和表2。

表1鲎试剂灵敏度复核结果(0.25 EU·m L-1)

表2鲎试剂灵敏度复核结果(0.125 EU·m L-1)

2.2供试品最大有效稀释倍数的确定

我司的内控标准为每1 mg苯磺顺阿曲库铵中含内毒素的量应小于2.0 EU。称取供试品适量，加稀释剂Ⅰ溶解，配成初始浓度为5 mg·m L-1的供试品溶液，按《中国药典》2015年版通则1143细菌内毒素检查法的规定，MVD=cL/λ，计算各灵敏度鲎试剂对应的样品最大有效稀释倍数(Maximum Valid Dilution,MVD):MVD0.25=40(0.125 mg·m L-1)、MVD0.125=80(0.062 5 mg·m L-1)、MVD0.06=160(0.031 2 mg·m L-1)、MVD0.03=320(0.015 6 mg·m L-1);在不超过对应MVD的稀释倍数下进行细菌内毒素检查。

2.3预干扰试验

用灵敏度为0.25 EU·m L-1的鲎试剂，对稀释倍数不超过320倍(即不低0.015 6 mg·m L-1)的不同浓度的溶液进行预干扰试验，以确定样品的不干扰浓度。称取供试品适量，加稀释剂Ⅰ适量使溶解，制备成初始浓度为5 mg·m L-1的溶液，用稀释剂Ⅰ分别稀至0.25、0.125、0.062 5、0.031 2 mg·m L-1作为2倍的供试品溶液备用。再用BET水分别稀至0.125、0.062 5、0.031 2、0.015 6 mg·m L-1(即分别稀释40倍、80倍、160倍、320倍)作为供试品阴性对照溶液。对这些浓度的苯磺顺阿曲库铵溶液进行细菌内毒素检测预干扰试验，将供试品阴性对照溶液(Negative product control,NPC)，供试品阳性对照溶液(Positive product control,PPC)，同时做2支阳性对照管(Positive control,PC)及2支阴性对照管NC，结果见表3。

表3样品预干扰试验结果

由表3结果知，供试品溶液(原液)的稀释浓度C在0.015 6～0.125 mg·m L-1时，对鲎试剂与细菌内毒素反应无干扰作用，且试验结果有效。则可选用灵敏度不低于0.25 EU·m L-1的鲎试剂进行正式干扰试验。

2.4干扰试验

根据预干扰试验结果，选用灵敏度为0.125EU·m L-1的鲎试剂进行正式干扰试验。称取三个批号的苯磺顺阿曲库铵，加稀释剂Ⅰ适量(V=M/5mg·m L-1)充分振荡使溶解，分别制备成初始浓度为5 mg·m L-1的溶液，用稀释剂Ⅰ稀释40倍至0.125 mg·m L-1后再用BET水稀释2倍至0.062 5mg·m L-1。将细菌内毒素标准品用BET水逐步配制成5个浓度的标准品溶液，即4λ(0.5 EU·m L-1)、2λ(0.25 EU·m L-1)、λ(0.125 EU·m L-1)、0.5λ(0.006 25 EU·m L-1)、0.25λ(0.0312EU·m L-1)。按细菌内毒素检查法进行干扰试验，结果见表4。

表4样品干扰试验结果

公式1

其中:Xs,Xt分别为鲎试剂标示灵敏度对照溶液和干扰试验溶液的反应终点浓度的对数值。

由表4结果可知，平行3批次干扰试验中，阴性对照溶液NC、供试品阴性对照溶液NPC的所有平行管均为阴性;两个厂家鲎试剂标示灵敏度对照系列的结果λc在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，符合鲎试剂灵敏度复核实验要求，试验有效。两个厂家鲎试剂干扰试验系列的结果Et在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，符合规定。说明供试品使用稀释剂Ⅰ溶解制成5 mg·mL-1，用稀释剂Ⅰ稀释40倍后用BET水稀释2倍，采用灵敏度λ为0.125 EU·mL-1的鲎试剂进行试验无干扰，可用于细菌内毒素检查。

2.5样品处理方法的有效性验证

由于苯磺顺阿曲库铵供试品的制备过程中采用了稀释剂Ⅰ，为考察供试品制备过程稀释剂Ⅰ对供试品本底细菌内毒素不存在破坏或不影响本底细菌内毒素的检出，通过在供试品中预先添加一定浓度的细菌内毒素(添加内毒素的体积小于供试品体积的10%)，按供试液制备方法制备后，最终得一系列含预加内毒素浓度为2λ、λ、0.5λ、0.25λ的溶液。制备方法如下:平行称取供试品两份，其中一份用稀释剂Ⅰ溶解，得供试品浓度为5 mg·m L-1的溶液。另一份加入内毒素溶液和稀释剂Ⅰ使溶解，得含内毒素浓度为20 EU·m L-1的供试品浓度为5 mg·m L-1的溶液，同干扰试验中确定的稀释倍数稀释，最终得未加内毒素的供试品阴性对照溶液、预加内毒素终浓度为2λ的溶液。取两份溶液等比例混合制成含内毒素终浓度为λ的溶液、取未加内毒素的供试品阴性对照溶液和含内毒素终浓度为λ的溶液等比例混合制成含内毒素终浓度为0.5λ的溶液、取未加内毒素的溶液和含内毒素终浓度为0.5λ的溶液等比例混合制成含内毒素终浓度为0.25λ的溶液。再用灵敏度为0.125 EU·m L-1的鲎试剂进行试验。结果见表5。

表5样品处理方法的有效性验证结果

由表5结果可知，平行3批次有效性试验中，阴性对照溶液NC、供试品阴性对照溶液NPC的所有平行管均为阴性;两个厂家鲎试剂标示灵敏度对照系列的结果λc在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，符合鲎试剂灵敏度复核实验要求，试验有效。两个厂家鲎试剂干扰试验系列的结果Et在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，说明供试品制备过程能有效地将供试品中的内毒素提取出。

2.6样品细菌内毒素检查

称取3个批号的供试品适量，加稀释剂Ⅰ溶解，制成5 mg·m L-1的供试品溶液。分别用稀释剂Ⅰ稀释40倍后再用BET水稀释2倍，使用λ为0.125EU·m L-1的鲎试剂，按所建立方法进行细菌内毒素检查，结果见表6。

由表6结果可知，阴性对照溶液NC的平行管都为阴性，阳性对照溶液PC的平行管都为阳性，供试品阳性溶液PPC的平行管都为阳性时，试验有效。供试品阴性对照溶液NPC的平行管都为阴性，供试品溶液符合规定。

3、讨论

由于苯磺顺阿曲库铵易与二价阳离子发生螯合作用，进而导致鲎试剂活性降低，对内毒素检查有一定的干扰作用，故考虑用补足二价阳离子的方法排除供试品对鲎试剂的干扰。首先考察供试品的干扰程度，初步确定供试品的不干扰稀释倍数，以便初筛出对检查无干扰的供试品浓度范围[5]。预试验结果表明，供试品稀释至40倍到320倍时无干扰作用，可以选择80倍进行正式干扰试验。

正式干扰试验是确定样品在该浓度下对细菌内毒素检测试验有无干扰，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据[6,7]。在正式干扰试验中，三批次的苯磺顺阿曲库铵干扰系列结果Et在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，说明供试品对细菌内毒素检测试验无干扰，可用于细菌内毒素检测。

表6样品细菌内毒素检查结果

样品处理有效性试验是通过在供试品中预先添加一定浓度的细菌内毒素，按供试液制备方法处理后，最终得一系列含预加内毒素浓度为2λ、λ、0.5λ、0.25λ的溶液。预先添加内毒素的供试品干扰试验系列的结果Et在0.5λ～2λ之间(包括0.5λ和2λ)，可认为供试液制备过程对供试品本底细菌内毒素不存在破坏作用。

本次试验结果表明，苯磺顺阿曲库铵加稀释剂Ⅰ溶解，制成5 mg·m L-1的供试品溶液。用稀释剂Ⅰ稀释40倍后再用BET水稀释2倍，用灵敏度为0.125 EU·m L-1的鲎试剂进行检查可行，具有简便、灵敏、快速、准确等优点，可满足苯磺顺阿曲库铵细菌内毒素的质量控制的要求。

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