结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染引起的结核病(tuberculosis, TB)是危害严重的慢性传染病[1]。据WHO发布的《结核病报告》,2021年全球新发TB感染1 060万人，因病死亡约160万人[2]。Mtb培养阳性为TB诊断的“金标准”,但存在耗时长(3～4周)、阳性检出率低(约30%)的局限性[3]。抗酸染色可用于鉴定分枝杆菌，但无法区分Mtb或非结核分枝杆菌(Non-tuberculous mycobacteria, NTM)感染[4]。结核菌素皮肤试验(Tuberculin skin test, TST)操作简单，但其敏感性和特异性不高，且无法区分卡介苗(Bacille Calmette-Guerin, BCG)接种与Mtb或NTM感染[5]。近年来，WHO推荐的γ-干扰素释放试验(Interferon-γ release assay, IGRA)和核酸分子检测诊断方法(Xpert)显著提高了TB诊断阳性率[6]。IGRA敏感性和特异性较高，但操作复杂且需要专门设备检测，限制了其在欠发达地区的推广使用。Xpert诊断可快速检出Mtb并同时分析是否为耐药菌的优点，但其敏感性仍有待提高[7]。因此，仍需研制用于早期Mtb感染的快速诊断新方法和技术。

MPT64为Mtb生长繁殖时期分泌的主要蛋白之一[8],由Mtb H37Rv差异编码区2(Regions of difference, RD2)中Rv1980c(mpt64)基因编码。MPT64仅存在于Mtb中，而不存在于BCG和绝大多数NTM中[9]。基于偶联碱性磷酸酶的鼠源抗MPT64单克隆抗体(Monoclonal antibody, mAb)建立的超敏ELISA,对TB患者痰液检测的敏感性和特异性分别可达88.0%和96.7%[10]。MPT64抗原检测法(SD Bioline Ag MPT64 Rapid?)检测Mtb培养物的敏感性为97%,特异性为99%[11]。在Ⅰ期和Ⅱ期临床研究中，以MPT64抗原固定于活动性TB患者前臂皮肤，其诊断敏感性和特异性分别为85%和100%[12]。此外，MPT64还可诱发Mtb感染豚鼠产生迟发型超敏反应，可用于TST辅助TB的诊断[9]。因此，MPT64被认为是具有应用潜能的TB早期诊断抗原之一。

本研究从已制备的小鼠抗MPT64 mAb[13]中选择2株高亲和力抗体，建立MPT64双抗体夹心ELISA检测方法，并评价其初步应用效果，为MPT64 mAb用于Mtb感染诊断提供实验依据。

1、材料与方法

1材料

鼠源抗MPT64-A5B2 mAb、H2F4 mAb由本实验室制备[13];HRP-Avidin和生物素(Biotin)偶联试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；TMB显色液购自北京天根生物科技有限公司；脱脂奶粉，牛血清蛋白(BSA),Middlebrook 7H9,Middlebrook 7H10及OADC购自美国BD公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白胨，酵母提取物和琼脂粉购自英国Oxoid公司。Mtb H37Ra、Mtb H37Rv、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Ms)、BCG、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)菌体蛋白，以及MPT64和CnpB重组蛋白均由本室制备[14]。

2方法

2.1 抗体亲和力、效价及亚类检测

采用ELISA 方法。用MPT64蛋白包被浓度为2 μg/mL,各株mAb作2倍梯度稀释，HRP-山羊抗小鼠IgG按试剂盒说明稀释，加入TMB显色后用酶标仪检测各孔A450值，确定抗体效价，计算相对亲和力。相对亲和力为mAb饱和浓度检测时A450最大值50%所对应的mAb浓度；抗体效价为显色阳性时的mAb最高稀释度。ELISA检测mAb抗体亚型，各株mAb作1∶500稀释，二抗分别为HRP标记的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。

2.2 ELISA叠加试验筛选配对抗体

用2 μg/mL MPT64蛋白包被酶标板，分别加入单株饱和mAb或等量两两组合的mAb, 37 ℃孵育1 h, 洗涤；加入HRP-羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h, 洗涤；加入TMB,显色后加入2 mol/LH2SO4终止反应，用酶标仪测定吸光度值A450值，计算叠加系数(Additivity index, AI)。AI=[2A(1+2)/(A1+A2)-1]×100%。式中A1和A2分别为单一mAb孵育测得的A450值，A(1+2)为2株mAb组合共孵育测得的A450值。AI值小于10%,表示2株mAb识别MPT64抗原的表位相近；AI值在10%～40%之间表示2株mAb识别MPT64抗原的表位有差异；AI值大于40%表示2株mAb识别MPT64抗原的不同抗原表位，即为配对抗体。

2.3 抗体的纯化及生物素标记

分别将配对抗体的2株mAb杂交瘤细胞腹腔接种雌性BALB/c小鼠，待诱发产生腹水后收集腹水，采用快速蛋白液相色谱系统(AKTA-FPLC)纯化腹水中的mAb[13]。将A5B2 mAb浓度调整至1 μg/ μL。取500 μL mAb、250 μL活化Biotin和250 μL偶联液混匀，室温反应2 h。用25 mL Biotin偶联液平衡脱盐柱，然后加入偶联混合产物，750 r/min(离心半径20 cm)离心8 min, 收集上层液体即为Biotin-A5B2 mAb。

2.4 双抗体夹心ELISA的建立

以H2F4 mAb为捕获抗体、Biotin-A5B2 mAb为检测抗体，采用棋盘滴定法优化2株mAb的组合工作浓度：将捕获抗体作梯度稀释(0.156～5 μg/mL)后包被酶标板，4 ℃孵育过夜；实验组(S)各孔加入MPT64抗原，阴性对照组(N)加入样品稀释液，室温孵育2 h; 加入梯度稀释的检测抗体(0.156～10 μg/mL),室温孵育1 h; 加入0.25 μg/mL HRP-Avidin孵育1 h; 加入TMB显色后检测A450值，计算值。S/N=实验组A450值/阴性对照组A450值。实验组A450值接近1,S/N较高孔对应的浓度即为捕获抗体和检测抗体的最适工作浓度。

2.5 双抗体夹心ELISA的优化

分别以碳酸盐缓冲液(CBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris-HCl(pH 6.6)和Tris-HCl(pH 8.8)稀释捕获抗体至1.25 μg/mL,37 ℃孵育1 h、2 h, 或室温孵育1 h、2 h, 或4 ℃过夜孵育；分别以BSA(5%、2%、1%)、脱脂奶粉(5%、2%、1%)和FBS(20%、10%、5%、1%)于37 ℃ 封闭1 h、2 h, 或室温1 h、2 h孵育；加入2 μg/mL抗原，37 ℃ 孵育1 h、2 h, 或室温孵育1 h、2 h; 加入2.5 μg/mL检测抗体，37 ℃孵育1 h、2 h, 或室温孵育1 h、2 h; 加入HRP-Avidin(0.016～1 μg/mL),37 ℃孵育30、60、90 min, 或室温孵育30、60、90 min; 加入TMB显色后检测A450值；S/N较高孔对应的条件即为最适反应条件。

2.6 检测限和线性范围评估

以H2F4 mAb为捕获抗体包被ELISA板，加入不同浓度MPT64为标准品，再加入Biotin-A5B2 mAb检测抗体。2% BSA为阴性对照(N组),以阴性对照组A450值的2.1倍为Cut-off, 当检测值≥Cut-off时为阳性，判断为阳性的最低MPT64浓度为检测限。绘制以A450值为纵坐标、MPT64浓度为横坐标的标准曲线，做直线回归分析。

2.7 精确性和准确性测定

以不同浓度的MPT64(理论值)测定双抗ELISA检测方法的精确性和准确性，根据标准曲线计算实验组的MPT64浓度(检测值)及其Mean、SD、SEM和变异系数(CV)。CV检验方法的精确性，回收率反映检测方法的准确性，回收率(%)=(检测值/理论值)×100%。

2.8 特异性检测

分别以MPT64制备过程中的原辅助材料和不同种菌体蛋白为待测样品，以纯化的MPT64蛋白为阳性对照，以Mtb CnpB重组蛋白为阴性对照进行ELISA,评价方法的特异性。原辅助材料包括LB液体培养基成分(胰蛋白胨、酵母提取物)和纯化液成分(咪唑、NaCl、甘油、Tris),菌体蛋白包括Mtb H37Rv、Mtb H37Ra、BCG、Ms、Spn。

2.9 Mtb培养上清中MPT64的检测

取Mtb H37Ra接种于7H9+10%OADC培养基，37 ℃、80 r/min震荡培养。分别于培养的不同时间检测菌落形成单位(Colony forming unit, CFU)。收集培养上清，冷冻干燥浓缩后以双抗体夹心ELISA检测MPT64浓度。以Mtb培养时间为横坐标、A450值或活菌数为纵坐标绘制生长曲线。以Mtb活菌数为纵坐标、以MPT64浓度为横坐标绘图，做线性回归分析。

2.10 统计学分析

以GraphPad Prism 9软件作图，实验结果以Mean±SEM表示。其中“*”表示S/N≥2.1,即为ELISA检测阳性。

2、结果

1 抗MPT64 mAb的鉴定

采用间接ELISA法检测9株杂交瘤培养上清中mAb的效价、亚类、相对亲和力，结果如表1。A2E7、A3D9、A5B2、C4F5、C8H9、D7G6、F5E2、H2F4、H4A11的抗体效价分别为1∶2 560、1∶2 560、1∶2 560、1∶2 560、1∶640、1∶320、1∶1 280、1∶1 280、1∶1 280,相对亲和力分别为3.13、6.25、3.13、6.25、12.5、25、6.25、12.5、12.5×10-6 g/mL。抗体亚类检测显示D7G6 mAb为IgG2a, 其他株mAb均为IgG1。

表1 9株MPT64 mAb的抗体效价及亚类

2 抗体配对检测

根据相对亲和力结果选择A5B2 mAb, 并筛选与其配对的其他株mAb, 结果如图1。有3株抗MPT64 mAb与A5B2 mAb的叠加系数AI值大于40%,分别是C8H9、F5E2、H2F4,表明其识别的MPT64抗原表位与A5B2 mAb不同，可组合为配对抗体。因此选择H2F4和A5B2株mAb用于后续试验。

图1 8株mAb与抗MPT64-A5B2 mAb的配对检测

3 配对抗体的效价检测

取H2F4与A5B2株杂交瘤细胞株注射小鼠腹腔，成功制备腹水。通过Protein A亲和层析纯化腹水mAb, 检测配对抗体的效价。结果显示，H2F4和A5B2株纯化mAb的抗体效价分别为1∶102 400(0.020 μg/mL)和1∶51 200(0.039 μg/mL)(图2),表明2株mAb均能较好地与MPT64蛋白结合。

4 捕获抗体与检测抗体组合浓度选择

将偶联生物素的抗MPT64-A5B2 mAb命名为Biotin-A5B2 mAb, 作为双抗体夹心ELISA的检测抗体。然后以H2F4为捕获抗体，棋盘滴定法确定抗体组合的浓度，结果如表2。当H2F4 mAb浓度为1.25 μg/mL,Biotin-A5B2 mAb为2.5 μg/mL时，实验组A450值接近1,S/N较高。因此采用该浓度组合进行后续试验。

图2 ELISA检测抗MPT64 mAb配对抗体的效价

表2 捕获抗体与检测抗体组合的优化

5 双抗体夹心ELISA试验条件的优化

对ELISA检测方法的各反应步骤或条件进行优化，优化的反应步骤或条件如表3。

表3 双抗体夹心ELISA试验条件的优化

6 双抗体夹心ELISA方法的敏感性验证

检测下限是可检测阳性的最低检测物浓度，也是反映ELISA敏感性的一个指标，检测下限越低，敏感性越好。用建立的ELISA方法检测MPT64重组蛋白，Cut-off值为A450=0.191,MPT64为39 ng/mL时，仍为阳性，即检测下限为39 ng/mL(图3 A)。线性范围是根据标准曲线量化检测抗原的最高至最低浓度的区间。经直线回归分析，当MPT64在39～1 250 ng/mL范围内时，MPT64浓度与A450检测值呈线性相关，其回归方程为y=0.000 8x+0.125(x为MPT64浓度，y为A450),R2=0.982 3(图3B)。

图3 双抗体夹心ELISA的检测限和线性范围验证A Detection limit verification B Linear range verification

7 双抗体夹心ELISA方法的精准性验证

精确性是对同一样品多次重复检测结果的一致性评估，变异系数(CV)越小，精确性越好。本研究建立的ELISA方法的CV为5.353%～9.459%,表明变异程度低，可重复性高，精确性良好。准确性是检测值与理论值之间的一致性评估，回收率越接近100%,准确性越好。本研究建立的ELISA方法的回收率检测均值为89.177%～104.390%,表明检测值与理论值接近程度高，准确性良好(表4)。

表4 双抗体夹心ELISA的精确性和准确性验证

8 双抗体夹心ELISA方法的特异性验证

以双抗体ELISA检测方法检测MPT64蛋白制备过程中所用的材料以及不同细菌蛋白，结果显示所有辅助材料检测均为阴性，与Mtb另一种蛋白CnpB无交叉反应(图4A)。Ms属于NTM,包含MPT64同源蛋白，其序列一致性为43.6%[13],Spn为呼吸道常见病原体。以双抗体夹心ELISA方法检测BCG、Ms和Spn菌体蛋白，结果均为阴性。当Mtb H37Rv菌体蛋白浓度高于50 μg/mL、H37Ra菌体蛋白浓度高于100 μg/mL时检测阳性(图4 B)。因此，本研究建立的双抗体夹心ELISA检测方法可特异识别Mtb中的MPT64,对不同毒力的Mtb菌株也有一定的识别能力，且不与无关蛋白反应，具有较好的特异性。

图4 双抗体夹心ELISA的特异性验证A Identification analysis of each component during the preparation of purified protein B Identification analysis of bacterial protein.

9 双抗体夹心ELISA方法的初步应用

绘制Mtb H37Ra菌株的生长曲线，呈现典型的“S”型，包含了迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期4个阶段(图5 A)。MPT64主要由对数生长期Mtb分泌，最早在培养的第12 d MPT64检测为阳性，与文献[13]的研究结果一致。当Mtb活菌量为5.1×105～5.55×107 CFU时，细菌培养上清中MPT64的浓度与Mtb活菌数量成正相关，其线性回归方程为y=17.237x+1.660 5(x为Mtb H37Ra活菌数CFU,y为MPT64浓度ng/mL),R2=0.992 5(图5 B)。

图5 Mtb培养上清双抗体夹心ELISA检测分析A Growth curve of Mtb H37Ra strain B Linear correlation verification of viable bacterial count between MPT64 and Mtb H37Ra

3、讨论

TB的微生物学诊断方法包括抗酸染色、分离培养，以及TST、IGRA、Mtb抗原检测和核酸检测等。其中Mtb抗原检测可用于TB早期快速诊断。双抗体夹心ELISA法将抗原-抗体特异性反应与酶高效催化反应相结合，实现了高特异性和高敏感性的组合，可用于抗原快速定量分析[15]。MPT64是Mtb活跃生长繁殖期分泌的一种蛋白[9],在BCG和绝大多数NTM中缺失，作为诊断试剂具有良好的特异性和敏感性。课题组在前期研究中制备了，本研究从前期制备的抗MPT64 mAb[13]中筛选出MPT64 mAb配对抗体，建立了双抗体夹心ELISA检测方法。

双抗体夹心ELISA检测方法的敏感性和特异性受抗原-抗体反应中多种因素的影响[16]。在抗原-抗体反应中，若抗体或抗原过剩，则抗原-抗体复合物形成减少，使待测抗原量低于实际含量，导致假阴性率高，因此需确定抗原-抗体的最适工作浓度。孵育时间和缓冲体系等也会影响检测结果。因此，本研究选择ELISA常规试剂和孵育条件作为初始反应体系，再依次对各步骤或条件进行优化，最大程度降低非特异性结合的影响，确定了双抗体夹心ELISA的最适检测条件。

双抗体夹心ELISA参数主要包括检测限、精确性、准确性以及特异性[17]。检测限是指可检测阳性的最低抗原浓度，也是反映ELISA敏感性的一个指标。本研究以mAb捕获抗体与mAb检测抗体配对进行ELISA,方法的检测下限为39 ng/mL。杨航等[18]报道以mAb捕获抗体与pAb检测抗体配对的MPT64抗原检测下限为1.5 ng/mL。mAb作为检测抗体可能仅识别一个抗原表位，而pAb中包含可识别多个MPT64表位的抗体，因此敏感性更高[19]。但是采用pAb为检测抗体假阳性率高，且特异性较低。精确性是对重复检测结果一致性的评估，变异系数CV越小，精确性越好；准确性是检测值与理论值之间一致性的评估，回收率越接近100%,准确性越好。国家规定，商品化的ELISA试剂盒需CV小于10%、回收率为80%～120%[20]。本研究建立的ELISA参数均在参考值范围内，表明其精确性和准确性良好。临床结核病诊断常存在假阳性的问题，如抗酸染色涂片和TST试验就无法区分Mtb感染、BCG接种和NTM感染。MPT64主要存在于Mtb, 基于MPT64抗体的胶体金免疫层析法在TB患者尿液中的检测特异性为100%[21]。鼠源抗MPT64 mAb偶联碱性磷酸酶建立的超灵敏ELISA在TB患者痰液检测中的特异性为96.7%[10]。MPT64抗原检测的电化学适体传感器法在TB患者血清[22]和痰液[23]检测中的特异性分别为93.3%和100%。本研究建立的MPT64双抗体夹心ELISA检测方法可特异识别Mtb不同毒力的H37Rv和H37Ra株，而与BCG、NTM中的Ms和常见呼吸道病原菌Spn的菌体蛋白均无交叉反应，因此该方法可区分Mtb与其他细菌感染，具有良好的特异性。

研究发现，MPT64为Mtb培养早期滤液的主要抗原之一，其在营养匮乏时表达下调[24]。用本研究建立的双抗体夹心ELISA检测Mtb生长各阶段培养上清，MPT64含量在一定范围内与Mtb的活菌数成线性正相关，并证实MPT64最早在Mtb培养第12 d检测阳性。表明本研究建立的双抗体夹心ELISA检测系统也可用于Mtb生长特性的检测，如果用于临床诊断，其检测下限仍有待提高。建立双株mAb检测抗体或多株mAb检测抗体的双抗体夹心ELISA方法，同时结合多聚酶HRP增加底物载量放大检测信号等方法，可提高该方法的检测敏感性，以满足临床快速诊断TB的需要。

参考文献:

[2]胡婧,周静,吴雯晶,等.结核病诊断T-SPOTTBMTB/RIF技术应用价值研究IJ1.中国病原生物学杂志,2022.17(12)1454-1458.1474.

[3]王鑫鑫,杜伟鹏,杨柳,荧光定量PCR检测尿沉渣TB-DNA在泌尿系结核病诊断中的应用(,临床研究,2023,31(1):113-115.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.81971560,82272343); 国家“十三五”重大传染病专项课题(No.2018ZX10302302002004); 陕西省重点课题(No.2022ZDLSF01-07);

文章来源:谢燕玲,宁唤唤,路延之等.结核分枝杆菌MPT64双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J].中国病原生物学杂志,2023,18(11):1284-1290.