侵袭性肺曲霉病(IPA)是指由曲霉菌所致的肺部感染疾病。随着器官移植广泛开展，免疫抑制剂和广谱抗菌药物的大量使用，使得IPA感染率呈逐年上升趋势[1]。IPA临床症状不典型，与病毒性肺炎难以鉴别。对IPA的诊断，主要根据临床表现、体征、影像学、实验室检测组织病理中发现45°角分枝的菌丝或曲霉头为金标准[2]。而在实际工作中，对曲霉菌的鉴定形态学传统手工法准确率低且耗时长，特别是少见曲霉菌，需依赖经验丰富的检验科工作人员。而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定时间短，准确率高，结合血清学方法，能极大提高曲霉病诊断的准确率。本研究对2020年1月至2021年3月重庆医科大学附属第二医院检出的56株曲霉菌株，采用传统手工法、分子测序、MALDI-TOF MS 3种鉴定方法进行比较。由医学真菌中心(南京皮肤病研究所)对菌株进行分子测序，评价本实验室传统手工法对曲霉菌的鉴定状况。针对MALDI-TOF MS方法，探讨适合于曲霉菌质谱鉴定的最佳前处理方式，实现曲霉菌质谱的快速鉴定，并建立一套适合实验室丝状真菌鉴定标准操作流程。

1、材料与方法

1.1标本来源

收集2020年1月至2021年3月重庆医科大学附属第二医院住院患者确诊或临床诊断为慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘、中耳炎、肿瘤患者的菌株，同一患者多次分离出同一丝状真菌以1株计算，共分离培养出曲霉菌56株，收集并保存菌种。其中肺泡灌洗液标本分离出12株，痰液标本分离出35株，纤支镜刷取物标本分离出3株，耳分泌物标本分离出4株，鼻窦分泌物标本分离出2株。

1.2仪器与试剂

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA,OXID有限公司，培养基为粉剂，需配制成固体培养基),OMEGA FUNGAL DNA KIT1000(广州飞扬生化科技有限公司代理),PCR扩增仪(美国BIO-RED S1000),DL2000 DNA Marker、2×TSINGKE Master Mix、通用引物β-tubulin(北京擎科新业生物技术有限公司),Bruker BioTyper系统(德国Bruker公司),甲酸和乙腈溶液(上海凌峰化学试剂有限公司)。

1.3方法

1.3.1传统手工法

按照《全国临床检验操作规程》真菌培养鉴定程序进行[3]。

1.3.2分子测序

提取模板DNA:按OMEGA FUNGAL DNA KIT1000试剂盒标准规程操作。目的基因扩增：按照以上步骤提取的DNA模板进行PCR扩增真菌ITS区域，本研究通用引物β-tubulinF:AATTGGTGGTGAAGATTTCTGG;R:AGTTGTCGGACGGAATAG[4]。PCR反应总体积50μL:DNA模板4μL,引物各1μL,2×TSINGKE Master Mix 12.5μL,蒸馏水6.5μL。PCR反应在PCR扩增仪中进行，设置PCR反应程序：95℃变性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸90 s,共35个循环，72℃保持延伸7 min。PCR扩增产物送安徽通用生物系统有限公司进行测序。将每一株丝状真菌的测序结果在Pubmed网站上通过BLAST检索，与数据库中条目进行比对，选择同源性最大的结果作为分子测序鉴定的结果。

1.3.3 MALDI-TOF MS鉴定

(1)甲酸乙腈萃取法[5,6]:用接种环刮取PDA培养3 d的菌落，挑取边缘菌丝，加入300μL纯水+900μL无水乙醇，以13 000 r/min震荡离心2 min,弃去上清液，干燥。加入70%甲酸50μL,4 000 r/min破壁震荡20 s,重复两次，放置5 min。加入乙腈50μL,放置5 min。以13 000 r/min离心2 min,取上清液为真菌蛋白模板。(2)锆珠碾磨甲酸乙腈萃取改良法：用接种环刮取PDA培养2 d的幼龄菌丝，挑入1 mL土豆肉汤中于摇床水平摇动28°增菌24 h,形成肉眼细密菌落，加入两粒锆珠，余下操作同甲酸乙腈萃取法。见图1。(3)取1μL真菌蛋白点靶，自然干燥后覆盖基质1μL,自然干燥后进行质谱鉴定。(4)鉴定评分：每株菌点靶两次进行鉴定，结果一致时的菌名和鉴定得分，将鉴定标准定为：鉴定到种得分≥2.0分；低于2.0分但所有鉴定结果前5位为同一种菌，得分在1.7～2.0分为鉴定到属，低于1.7分或鉴定结果为多种菌为无鉴定结果。

图1烟曲霉菌在空气摇床水平震荡和垂直震荡及在土豆 肉汤培养24 h的结果  下载原图

注：A为水平振摇形成的细密菌落图；B为垂直振摇的细密菌落图；水平振摇获得菌丝更为均匀和细致。

1.4统计学处理

采用SPSS19.0和WHONET5.6软件对收集到的数据进行统计汇总分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 56株曲霉菌采用3种方法进行鉴定的结果比较

以分子鉴定结果为金标准，质谱鉴定种属52株，准确率为92.9%(52/56),手工鉴定32株，准确率为57.1%(32/56)。质谱鉴定的准确率明显高于手工鉴定(P<0.05)。见表1。

2.2两种丝状真菌蛋白提取法质谱结果比较

56株曲霉菌采谱方式有两种：一种为PDA固体培养72 h取菌丝，按照锆珠碾磨甲酸乙腈萃取改良法提取蛋白液采谱，质谱鉴定到曲霉菌种属准确率为73.2%(41/56);第二种为用PDA液体水平振摇24 h取菌丝采谱，再以锆珠碾磨甲酸乙腈萃取获得菌丝蛋白液，质谱鉴定到曲霉菌种属准确率为92.9%(52/56)。两种采谱方法比较，差异有统计学意义(P<0.05)。曲霉菌采用PDA液体水平振摇培养24 h取得的质谱图更优。见表2。

表1 56株曲霉菌采用3种方法进行鉴定的结果比较(n)

表2两种丝状真菌蛋白提取法质谱结果比较(n)

2.3 PDA培养天数对质谱鉴定曲霉菌能力的影响

本研究选用PDA对56株曲霉菌株进行培养，并分别在2、3、5、7、9 d提取真菌蛋白，运用BRUKER MALDI-TOF MS进行采谱，PDA培养2 d质谱鉴定到种的准确率为25.0%,3 d为37.5%,5 d为33.9%,7 d为8.9%,9 d为1.7%。培养3、5 d质谱鉴定准确率分别为73.2%(41/56)和75.0%(42/56),其质谱鉴定准确率优于培养2、7、9 d的质谱鉴定准确率，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 PDA培养天数对质谱鉴定曲霉菌能力的影响(n)

3、讨 论

在治疗曲霉菌感染的患者时，获取准确的病原菌信息至关重要，因为不同的曲霉菌对药物的灵敏度不同，有的甚至存在天然耐药。如大部分曲霉菌对两性霉素B敏感，而土曲霉菌对两性霉素B天然耐药，黄曲霉菌可以出现获得性耐药[7,8]。因此指导临床合理使用抗真菌药物，必须准确快速地鉴定曲霉菌到种。曲霉菌现有鉴定方法包括传统手工法、分子测序、MALDI-TOF MS技术等。分子测序为丝状真菌鉴定的金标准，但是它对操作人员技术要求高，操作复杂，费用昂贵，不适合成为实验室常规的检测方法[9];曲霉菌传统手工法鉴定需要数天时间，对菌落的生长速度、色素变化及镜下菌丝和孢子结构进行观察，要求检验人员有专业的技术和丰富的鉴定经验，易产生较大的人为误差，本实验室对56株曲霉菌采用传统手工法鉴定到种准确率只能达到57.1%(32/56),与相关研究结果一致[10]。近年来MALDI-TOF MS技术已广泛用于细菌的鉴定[10,11],操作简便、快速、高通量、且准确性高，临床应用取得良好效果。

MALDI-TOF MS是临床微生物病原菌鉴定的新型软电离质谱技术，其通过检测微生物蛋白质指纹图谱，根据不同菌种特有的质谱峰与质谱图数据库进行比对，进而快速得出微生物鉴定结果，在细菌同源性分析、病原菌分型、毒力因子鉴定及耐药检测等方面表现出优势[12,13]。在真菌的快速鉴定中，近年张霄霄等[14]发现MALDI-TOF MS技术可将酵母样真菌的鉴定准确率从传统手工法的79.6%提高到95.1%。SLEIMAN等[15]结合德国布鲁克MALDI-TOF MS丝状真菌数据库和实验室自建18种曲霉菌谱图，将曲霉菌种鉴定准确率提高了24.0%,对传统手工法仅鉴定到属的曲霉菌株均实现了种鉴定。上述研究表明，MALDI-TOF-MS技术在临床真菌鉴定中的作用日益显著，然而质谱技术应用缺少实践和经验积累，尤其丝状真菌结构复杂，鉴定过程复杂，目前仍处于探索阶段。本研究从临床分离出56株曲霉菌，对比传统手工法和MALDI-TOF MS技术，结果显示，以分子测序结果为金标准，MALDI-TOF MS技术鉴定丝状真菌到种的准确率为92.9%,明显高于传统手工法鉴定的57.1%(P<0.05)。

在MALDI-TOF MS技术运用中，布鲁克公司丝状真菌数据库基于液体法建立，认为曲霉菌在液体培养法中采谱能得到更高鉴定准确率。本研究首先比较了PDA液体培养水平和竖直两种振摇方式得到的菌丝结果，发现水平振摇获得菌丝更为均匀和细致；再比较了PDA固体培养72 h和PDA液体培养水平振摇24 h两种方式，得到的菌丝质谱鉴定到种属的鉴定准确率分别为73.2%和92.9%,两种采谱方法比较，差异有统计学意义(P<0.05),采用PDA液体水平振摇培养24 h取得的质谱图更优。曲霉菌质谱蛋白的提取法分为完整细胞法和细胞裂解法。甲酸萃取法为完整细胞法，郜珠研磨法属于细胞裂解法，VITEK MS质谱仪推荐的丝状真菌质谱分析前处理的蛋白质提取方法为甲酸乙腈法[16]。宗来斌等[17]采用甲酸乙腈萃取法对47株曲霉菌进行前处理后，质谱鉴定准确率为79.8%;本研究采用郜珠研磨法加上甲酸乙腈萃取法，质谱鉴定准确率达92.8%,且本法获得的质谱图特征峰数量更多，强度更高。分析原因可能是：(1)提取过程中加入一定量郜珠，可与菌丝相互碰撞、剪切，使蛋白质释放更为充分，一定程度上提高了难破碎菌株的蛋白图谱质量与鉴定效果；(2)PDA水平振摇培养24 h得到的真菌丝的壁较薄且均匀，郜珠震荡更容易破壁，因而甲酸乙腈萃取到的核酸蛋白更多。

丝状真菌的胞壁坚韧、难以破碎，常规方法难以获得足量蛋白质。影响真菌蛋白质获取的因素除提取方法外，还包括培养基选择、提取蛋白时间等[18]。真菌常用的培养基有沙堡弱葡萄糖琼脂(SDA)、察氏培养基(CA)和PDA。DE CAROLIS等[19]的研究表明不同培养基(SDA、MA或PDA)对MALDI-TOF MS的鉴定结果无影响。因此本研究选用PDA对56株曲霉菌进行培养，并分别在2、3、5、7、9 d提取真菌蛋白，运用MALDI-TOF MS进行采谱，结果培养3 d和5 d的质谱鉴定准确率分别为73.2%和75.0%,优于培养2、7、9 d的鉴定准确率，差异有统计学意义(P<0.05)。因此将PDA平板培养丝状真菌提取蛋白时间定于3～5 d。

综上所述，本着丝状真菌鉴定准确、快速和安全的原则，本研究摸索出一套适合本实验室的操作方法：呼吸道或耳鼻窦分泌物标本培养3～5 d,期间发现曲霉菌菌落可以挑取菌丝于PDA液体培养基中水平振摇培养24 h,所得菌丝采取郜珠研磨，甲酸乙腈萃取蛋白，MALDI-TOF MS采谱鉴定。此方法操作简单、快速、结果准确且重复性好，完全可以满足临床需要，已在本实验室得以应用，并适于在临床微生物实验室中推广。相信将来MALDI-TOF MS技术在各临床实验室中应用会越来越广泛，并逐渐取代传统手工形态学鉴定方法。

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基金资助:国家科技部重点研发计划(2020YFC2008900,2020YFC2008903);

文章来源:张春华,胡明冬,蒋敏等.3种方法对曲霉菌鉴定结果对比研究[J].国际检验医学杂志,2023,44(23):2938-2941.