首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 感控科论文 > 抗菌药物论文 > 黄连素对幽门螺杆菌多重耐药株hefABC基因表达的影响

黄连素对幽门螺杆菌多重耐药株hefABC基因表达的影响

2024-08-05 80 上传者：管理员

摘要：目的研究黄连素（BBR）在幽门螺杆菌（Hp）多重耐药（MDR）菌株外排泵基因hefABC调控中的作用。方法 (1)通过E-test药敏实验检测阿莫西林（AMX）、左氧氟沙星（LEV）、克拉霉素（CLR）、甲硝唑（MTZ）对临床分离Hp菌株的最小抑菌浓度（MIC），从中筛选出敏感株和MDR株；(2)采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）测定敏感株与MDR株中外排泵基因hefABC mRNA的表达水平；(3)测定黄连素对MDR株的MIC值，在1/2 MIC黄连素浓度下液体培养MDR菌株，培养5代后用RT-PCR测定黄连素作用前后hefABC mRNA的表达量变化。结果 (1)从60株分离菌株中筛选出敏感株15株，MDR株12株；(2)与敏感组相比，外排泵基因hef'A、hefB的表达量在MDR组中明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）,hefC基因的表达水平在两组之间无明显差异；(3)黄连素作用后外排泵基因hef'A、hefB的表达量与作用前相比明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 (1)Hp的多重耐药与外排泵基因hefA、hefB表达量的上调有关。(2)黄连素通过下调外排泵基因hefA、hefB的表达抑制部分MDR菌株的耐药性。

关键词：
外排泵基因
多重耐药
幽门螺杆菌
消化道传染
黄连素
加入收藏

幽门螺杆菌（Helicobater pylori,Hp）感染广泛存在于全球一半以上的人群中，主要通过消化道传染，现代研究证实Hp感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌等多种消化道疾病的发生、发展密切相关[1]。自从三联方案作为根除Hp的经典方案以来，因依赖于抗生素的使用，国内甲硝唑（metronidazole,MTZ）、克拉霉素（clarithromycin,CLR）以及左氧氟沙星（levofloxacin,LEV）的耐药率分别已高达40%～70%、20%～50%和20%～50%，对CLR、MTZ的双重耐药率超过15%，且多重耐药率逐年上升[2]。严峻的耐药形势严重影响了Hp的根除率[3]。如何优化抗Hp方案以提高Hp的根除率迫在眉睫。

Hp的耐药机制主要有抗菌药物的靶基因突变、外排系统的激活、细菌球形变、诱导自噬以及与耐药相关毒力因子的分泌[4]。其中外排泵系统参与多种抗生素的泵出如阿莫西林（amoxicillin,AMX）、MTZ、CLR等，是革兰阴性菌发生多重耐药（multidrug resistant,MDR的主要机制之一[5]。而耐药结节细胞分化（Resistance nodulation-cell division,RND）家族中的AcrAB-TolC外排泵是Hp最重要的外排系统[6]，能识别广泛的底物发挥外排作用。外排泵系统，目前研究最多的是hefABC系统[7]，抑制外排泵基因的表达能逆转细菌的多重耐药表型。因此，寻找安全有效的外排泵抑制剂成为近年来的研究热点。但目前能用于临床的外排泵抑制剂只有奥美拉唑等质子泵抑制剂，很多学者将目光投向了中医药。

我们前期研究发现，黄连素能逆转部分MDR菌株对常用抗生素的耐药性，但其相关作用机制尚不明确。有研究表明[8]黄连素能抑制MDR金黄色葡萄球菌NorA和RamR外排泵的表达，为了明确黄连素在外排泵hefABC基因调控中的作用，本文在阐明hefABC基因与Hp多重耐药关系的基础上，用亚抑制浓度的黄连素传代培养MDR株后，检测黄连素作用前后hefABC基因的表达量变化。

1、资料与方法

1.1实验菌株：

本实验所用的Hp菌株来自上海市普陀区中心医院内镜室2017年9月至2018年10月期间行胃镜检查且组织活检经尿素酶试验检测为阳性的患者，在中心实验室通过体外分离培养获得，并同时经3种方法（形态学、过氧化氢试验、革兰染色）鉴定为Hp菌落。质控菌株ATCC 43504购自上海普盛生物科技有限公司。本研究经过医院伦理委员会审批通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂和仪器：

98%黄连素原药（Sigma生物公司，批号：SLBB2771V），飞驰E-test试纸条（上海枫岳生物科技有限公司），OXOID脑心浸液粉（上海典森生物科技有限公司，批号：2309228），哥伦比亚琼脂粉（上海典森生物科技有限公司，批号：2160231),Gibco无菌胎牛血清（上海睿安生物科技有限公司，批号：42Q8275K），无菌脱纤维绵羊血（上海顺威生物技术有限公司），Trizol Reagent(ambion生物科技有限公司），实验中所用的引物均由生工生物有限公司合成，PrimeScript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒均购自宝日医生物技术有限公司，A400型27位多点接种仪（上海典森生物科技有限公司，型号A400-027S），三气培养箱（赛默飞世尔科技有限公司，型号HERAcell vios160i),ABI ViiA 7 Real Time PCR System(Applied Biosystems公司）。

1.3方法

1.3.1检测分离株的耐药性：

采用E-test法分别检测分离株对4种抗生素的耐药性，步骤如下：将生长良好的菌落收集在无菌生理盐水中，用麦氏比浊管调整浓度为2.0比浊度；吸取100μL菌液至培养基上，用接种环涂布均匀并完全晾干；将抗生素E-test试纸条轻放至平板表面，在三气培养箱中微需氧培养3d后判定菌株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）。以标准菌株ATCC43504作为质控菌株。耐药判定标准如下：AMX:MIC≥1μg/mL,LEV:MIC>2ug/mL,CLR:MIC≥2μg/mL,MTZ:MIC≥8μg/mL。从中筛选出敏感株和MDR株。

1.3.2测定黄连素对MDR株的MIC值：

制备黄连素终浓度为4～256μg/mL的倍比稀释琼脂平板；将MDR菌株制成2.0麦氏比浊度的菌液，用27孔多点接种仪依次将菌液接种于制备好的平板上，同时以ATCC 43504作为质控菌株，以不含黄连素的平板作为空白对照，微需氧培养3d后读取黄连素对各菌株的MIC值。

1.3.3黄连素传代培养MDR株：

将MDR菌株在脑心浸液培养基（含10%胎牛血清）中复苏，传代培养3代后，实验组加入终浓度为1/2 MIC的黄连素原液，对照组加入相同体积的双蒸水，放入三气培养箱中培养，同时以150 rpm的速度摇菌，每36h传代培养1次，传代5次。

1.3.4测定各组菌株AcrAB-TolC外排泵基因的表达量：

采用RT-PCR分别检测S组和MDR组，MDR株经黄连素作用前后各外排泵基因的表达量，步骤如下：①用Trizol试剂盒提取菌株的总RNA；②去除基因组DNA后进行反转录反应，反应体系：反应液10μL、PrimeScript RT Enzyme Mix 1μL、RT Primer Mix 1μL、5×Prime-Script Buffer 4μL、无酶ddH2O 4μL；反应条件：37℃15min,85℃5s,4℃保温；③PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq 5μL、上下游引物各0.3μL、ROX Reference Dye 0.2μL、灭菌ddH2O 2.2μL、cDNA 2.0μL；反应条件：95℃、30 s,95℃、5 s,60℃30 s共40个循环。各引物序列和产物大小见表1。采用2-△△Ct法计算各目的基因的相对表达量（RQ值）。

1.4统计学分析：

运用SPSS 21.0统计软件分析各组hefABC相关蛋白编码基因mRNA的表达量差异，方差齐的数据采用独立样本t检验，方差不齐采用独立样本秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1临床分离株的耐药性：

从60株分离株中筛选出S株15株、MDR株12株，各菌株对4种抗生素的MIC值见表2-3。

表1 hefABC基因和内参基因引物序列及产物大小

表2四种抗生素对各敏感株的MIC值（ug/mL)

表3四种抗生素对各MDR株的MIC值（ug/mL)

2.2敏感组与MDR组外排泵基因的表达量：

如表4所示，与敏感组相比，hefA、hefB在MDR组的表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05);hefC在MDR组中的表达量升高不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。

表4 hefABC基因在敏感组和MDR组中的表达情况

2.3敏感组与MDR组外排泵基因表达量与抗生素耐药性的相关性：

采用SPSS 21.0软件对MDR组hefA、hefB基因表达量与对应抗生素的MIC值进行相关性分析，得到的r值和P值如表5。

表5 MDR组外排泵基因的表达量与对应抗生素的MIC值的相关性

2.4 MDR株对黄连素的耐药性：

黄连素对标准株ATCC 43504的MIC值为32ug/mL，对MDR株的MIC值在8～128ug/mL水平，黄连素对MDR株的MIC值主要分布在32ug/mL。

2.5 MDR菌株经黄连素作用前后各外排泵基因的表达量：

如表6所示：MDR株经黄连素威迫培养5代后，hefA、hefB表达量明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。

表6黄连素作用前后hefABC基因在MDR组中的表达变化

3、讨论

AcrAB-TolC外排泵由膜融合蛋白（AcrA）、外排转运蛋白（AcrB）和外膜通道蛋白（TolC）组成三聚体复合物，将抗生素等有毒物质排出细胞外发挥作用[9]。hefABC作为编码AcrAB-TolC系统的同源基因，hefA、hefB、hefC分别编码TolC、AcrA,AcrB蛋白的表达。hefABC广泛存在于Hp菌株中，参与多种抗生素的耐药过程，且与细菌的多重耐药密切相关[10]。本研究结果表明：hefA、hefB在敏感组中表达很低，而在MDR组表达明显升高，hefC在两组之间表达差异不明显，提示Hp的多重耐药与hefA、hefB基因的高表达有关。两项研究[11-12]提示hefA、hefB、hefC的高表达与CLR、LEV、MTZ、AMX的耐药及多重耐药均密切相关，三者在MDR组中的表达量最高，且其表达具有协同性。这与本研究结果相似，但不同的是，本研究结果显示hefC在MDR菌株中未见高表达。除了不同来源的临床菌株之间的生物学性状差异所致之外，我们推测hefABC的表达不一定表现为同步升高的形式，AcrA、AcrB、TolC同时受多种外排泵基因的调控，在hefC基因表达处于抑制状态时，可能存在其他基因如hefF、hefI、Hp1487的高表达。AcrAB-TolC三聚体也不一定以固定的组合形式发挥作用，而是可以随机组合搭配[15]，尤其是TolC可与大多数转运酶共享[16]。综上所述，外排泵基因hefA、hefB的上调是Hp产生多重耐药的机制之一。为了进一步明确hefA、hefB的表达量与相应抗生素MIC值的关系，我们对其进行了相关性分析。与陈元旺[13]的报道相似，hefA、hefB在MDR菌株中的表达量与其MIC值无明显相关性。我们推测这是因为Hp多重耐药的产生由多种机制调控，外排泵机制与其他机制（如耐药基因突变）共同作用导致了细菌的多重耐药。

很多中药成分具有天然抗菌活性，黄连素又名小檗碱，是从小檗属植物中提取的一种生物碱，是黄连有效成分中主要的抑菌单体[14]，临床上历来用于治疗感染性消化道疾病。我们前期研究发现黄连素能降低部分MDR菌株的MIC值，其相关机制尚不明确。有学者报道黄连素可通过抑制大肠杆菌外排泵的表达、消除耐药质粒、上调抗生素靶蛋白表达、阻碍细胞壁合成等多靶点影响细菌的耐药性。本研究结果显示：hefA、hefB在MDR株中的表达量较敏感株显著升高，经黄连素处理后其表达量明显降低，说明黄连素具有外排泵抑制作用，可通过下调hefA、hefB的表达逆转MDR株的耐药性。刘三峡报道[15]黄连素能通过抑制MDR大肠杆菌中AcrA基因的表达提高其对喹诺酮类抗生素的敏感性，与本研究结果一致。另外，hefC在黄连素处理前后表达量无明显差异，我们推测可能是因为hefC在MDR菌株中表达量很低或处于抑制状态，所以经黄连素作用后表达量变化不大。

Hp的多重耐药受多种机制的有序调节，其中外排泵基因hefA、hefB的表达量上调是Hp产生多重耐药的机制之一，而黄连素可通过抑制hefA、hefB的表达部分逆转其耐药性。目前对于外排泵相关机制的研究仍处于初步探索阶段，hefABC系统与其他机制之间的相互联系仍需进一步深入研究，这有助于开发新的作用靶点来抑制外排泵活性[16]。黄连素作为一种植物性抗生素，在增强MDR株的敏感性的同时，具有外排泵抑制作用。黄连素或可作为一种新型外排泵抑制剂研究开发，对于缓解目前棘手的抗生素耐药问题具有很好的应用前景与经济效益。

参考文献:

[2]刘文忠,谢勇,陆红,等.第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告[J].胃肠病学,2017,22(06):346-360.

[4]侯宠,刘一品.幽门螺杆菌抗菌药物耐药分子机制的研究进展[J].胃肠病学,2021,26(03):171-175.

[10]童静,李昌平.外排泵系统与幽门螺杆菌抗生素耐药性的研究进展[J].现代临床医学,2022,48(06):461-464.

基金资助:国家自然科学基金(青年)项目(81603468);湖州市科技局公益性应用研究项目(2023GYB15);

文章来源:周帆,徐小青,彭君伟,等.黄连素对幽门螺杆菌多重耐药株hefABC基因表达的影响[J].哈尔滨医药,2024,44(04):1-4.