念珠菌感染是一种最常见的临床真菌感染性疾病之一[1]，其发病率在过去的几十年不断上升，感染范围从浅表性的皮肤黏膜疾病至造成严重系统感染和重要器官衰竭的侵袭性疾病。念珠菌感染经常发生于新生儿，免疫缺陷状态（如HIV感染、恶性肿瘤、糖尿病和包括器官移植在内的各种侵袭性手术等）和接受广谱抗生素或免疫抑制剂治疗的患者身上，念珠菌感染的主要病原体是白念珠菌[2-3]。目前临床上抗真菌药物有唑类、多烯类、特比萘芬类、棘白素类等。近年来随着多重耐药念珠菌的流行，棘白菌素和咪唑类药物价格昂贵，使得抗真菌治疗面临严重挑战。因此，从中药中筛选抗真菌药物具有重要价值，可能为治疗念珠菌感染提供新的策略。

芍药汤源于刘完素的《素问病机气宜保命集》，由芍药、当归、黄连、槟榔、木香、炙甘草、大黄、黄芩、肉桂组成，具有清热燥湿、调和气血的作用，临床上广泛运用于治疗阿米巴痢疾、溃疡性结肠炎、细菌性痢疾、过敏性结肠炎等消化系统性疾病。芍药汤中芍药苷[4]、小檗碱[5]、肉桂醇[6]、甘草酸[7]、黄芩素[8]均已被证实具有一定抗菌作用，但其组方并未验证对念珠菌是否有效。本研究探究芍药汤在治疗白念珠菌感染性疾病中的应用，采用体外抗菌试验方法观察芍药汤对白念珠菌的抑菌效果，进一步研究芍药汤对白念珠菌生物膜的抑制机制，现在报道如下。

1、材料

1.1仪器

BS-MFL-01麦氏比浊仪（珠海内索生物技术有限公司）；压力蒸汽灭菌器（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；冷冻干燥机（长沙巴跃仪器有限公司）；扫描电子显微镜、激光共聚焦显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2试剂与药材

白芍、黄连、大黄、黄芩、槟榔、当归、甘草、木香、肉桂均购于江西江中中药饮片有限公司。RP1640培养基（Gibco公司）；蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉、氯霉素溶液、3-(N-吗啉基）丙磺酸（MOPS）缓冲液（生工生物工程上海股份有限公司）；FUN-1荧光染料、甲基四氮盐（XTT）（美国Invitrogon公司）；PBS缓冲液、结晶紫染色液（Solarbio公司）。

1.3实验菌株

白念珠菌临床菌株（N1、L24）来自皮肤黏膜白念珠菌感染患者；白念珠菌标准株（ATCC90028）来源于中国医学科学院微生物生物菌（毒）保藏管理中心真菌中心。

2、方法

2.1芍药汤的制备

按芍药汤处方量称取各饮片，取白芍30 g，当归15 g，黄连15 g，黄芩15 g，槟榔6 g，木香6 g，炙甘草6 g，大黄9 g，肉桂5 g，加入饮片总质量10倍体积纯水，浸泡药材30 min，煎煮1 h,8层纱布过滤药液，药渣再加入8倍体积的纯水，煎煮1 h，再次过滤，合并2次过滤药液，离心过滤去除药渣，煎煮加热浓缩至1 g/mL的芍药汤生药液，使用冷冻干燥机冷冻8 h，即得芍药汤干粉，4℃冷藏保存。

2.2菌悬液及接种悬液的制备

将保藏于-80℃冰箱的试验菌株复苏，在沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上传代接种2次菌株，35℃生化培养箱中培养24 h，用接种环挑取直径≥1 mm的菌株，悬浮于4 mL 0.85%NaCl灭菌溶液中，涡旋振荡10 s，调整菌悬液终浓度至0.5麦氏浊度，制备成终浓度为1×106～5×106CFU/mL菌悬液，将菌悬液用药敏培养基0.2%葡萄糖RPMI 1640培养基按1∶1 000稀释，稀释至终浓度为1×103～5×103CFU/m L的接种悬液。

2.3最小抑菌浓度（MIC50）及最小杀菌浓度（MBC）测定

根据M60药敏试验方案[9]，用药敏培养基稀释芍药汤干粉至终浓度为400 mg/mL的芍药汤溶液。在芍药汤的96孔板第1孔中加入100μL芍药汤溶液和100μL药敏培养基，用移液枪混匀吸取100μL混匀液体至第2孔，依次按照2倍比稀释至10孔，芍药汤的终浓度为0.391 mg/mL,11孔设置为只加药敏培养基不加菌的阴性对照组，12孔设置为只加菌不加药的阳性对照组。在24 h时观察各孔真菌的生长情况，比较阳性、阴性对照组，记录芍药汤的MIC50和MBC值。

2.4扫描电子显微镜（SEM）及激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）下观察白念珠菌形态变化

取HEPES缓冲注1.191 5 g和葡萄糖1 g，加入纯水50 mL，充分混匀后将pH值调节至7.0，使用0.22 nm无菌膜过滤。用配置好的缓冲液将FUN-1荧光染液稀释至25µmol/L。将200µL菌悬液置于已放入细胞玻片的24孔组织板中，各孔加入300µL不同浓度的芍药汤（40.30、20.15、10.08 mg/mL），将其设为实验组。空白对照组只加200µL菌悬液和300µL药敏培养基，37℃培养24 h后取出细胞玻片，使用PBS缓冲液，反复冲洗3次，进行FUN-1荧光液染色，用CLSM观察生物膜结构，并运用Image J对生物膜进行三维重建，测量生物膜厚度。

同上述步骤，设置实验组及对照组，37℃培养24 h后，使用PBS缓冲液，反复冲洗3次，2.5%戊二醛固定过夜，将菌株取出，在不同浓度（50%、70%、100%）的乙醇中洗涤脱水20 min，然后用液态CO2进行临界点处理，涂上胶体金，用加速电压为5 kV的SEM观察。

2.5 XTT减低法测量白念珠菌代谢活性

2.5.1芍药汤对白念珠菌生物膜形成的影响

取4µL浓度为10 mmol/L维生素K3加入40 mL浓度为0.5 mg/mL XTT液体中，配置成维生素K3/XTT混合液，避光储存，现配现用。取100µL倍比稀释的芍药汤（40.30～0.31 mg/mL）与100µL菌悬液，共200µL，同时加入96孔微量培养板中，将其设为实验组。空白对照组予100µL菌悬液和100µL药敏培养基，在37℃恒温培养箱培养，在培养的不同时间点（2、6、12、24、48 h），吸取96孔组织板中上悬液，用PBS缓冲液反复冲洗3次，各孔加入200µL维生素K3/XTT混合液，用锡箔纸包裹组织培养板，避光培养3 h。用移液枪吸取上述培养板上清液100µL，并置于新的96孔组织培养板中，放入多功能酶标仪中，波长设定为490 nm，进行测定吸光度OD值，每个时间点均有4个孔作为重复，实验在不同时间重复做3次，取平均值。

2.5.2白念珠菌生物膜形成的不同阶段对芍药汤的敏感性测定

取100µL菌悬液加入96孔微量培养板中，在37℃恒温培养箱培养，在培养的不同时间点（2、6、12、24、48 h）加入100µL倍比稀释的芍药汤（40.30～0.31 mg/mL），同上述步骤放入多功能酶标仪中，每个时间点均有4个孔作为重复，实验在不同时间重复做3次，取平均值。

2.6结晶紫染色法测定白念珠菌生物膜量

方法同“2.5.1”项下制备96孔板生物膜，在培养的24 h内用PBS缓冲液反复冲洗3次。在室温条件下干燥2 h后，每孔加入200µL 0.5%结晶紫染色液，避光室温条件下静置20 min，用纯净水轻柔冲洗2 min，室温条件下干燥3 h后，每孔再加入200µL 90%乙醇，静置30 min。用移液枪吸取上清液100µL，并置于新的96孔组织培养板中，放入多功能酶标仪中，波长设定为590 nm，进行测定吸光度OD值，每个时间点均有4个孔作为重复，实验在不同时间重复做3次，取平均值。

2.7统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量数据用均数±标准差表示，符合正态分布2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析比较方法；不符合正态分布的2组间比较用非参数性检验，多组计量数据则用多组独立样本比较的秩和检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

3、结果

3.1芍药汤对白念珠菌的抗菌活性

根据M60药敏试验方案[9]，芍药汤对白念珠菌的MIC50和MBC平均值为1.60 mg/mL和20.15 mg/mL。依据XTT减低法测定芍药汤对白念珠菌的SMIC50平均值为5.04 mg/mL。结果表明，芍药汤对白念珠菌具有体外抗菌活性。

3.2在SEM和CLSM下观察芍药汤对白念珠菌生物膜的破坏

使用SEM观察芍药汤干预后的菌丝形态。空白对照组显示酵母相细胞和菌丝细胞相互黏附，形成结构稳定、彼此交错的网格结构，两性细胞壁表面光滑，生物膜结构完整，细胞质均匀，见图1A。实验组中芍药汤浓度为10.08 mg/mL时，主要为酵母相细胞及少量短小的菌丝相细胞，短小的菌丝相细胞彼此粘连，形成较小的芽管结构，细胞壁表面粗糙肿胀，见图1B。当芍药汤浓度为20.15 mg/mL时，未见菌丝相细胞，酵母相细胞彼此粘连紧密，细胞壁表面凹陷及皱缩，见图1C。芍药汤浓度为40.3 mg/mL时，细胞壁变形加剧，细胞内容物泄漏，见图1D。

通过CLSM进一步证实了SEM的结果，空白对照组主要显示为以三维网状的红色荧光为主，细胞分布较密集紧凑，荧光强度较实验组更亮，生物膜活性更高，见图2A。芍药汤浓度为10.08 mg/mL时，红色荧光小体数量减少，可见少数绿色荧光小体，荧光小体排列较对照组疏松，仅见单层结构，见图2B。芍药汤浓度为20.15 mg/mL时，生物膜细胞更为稀疏，荧光强度减弱，绿色荧光小体增加，见图2C。芍药汤浓度为40.30 mg/mL时，主要以绿色荧光小体为主，白念珠菌生物膜空间结构受到严重破坏，细胞密度降低，细胞排列稀疏，见图2D。

3.3芍药汤对白念珠菌生物膜厚度的影响

芍药汤对白念珠菌菌体及胞外基质产生一定影响，因此，生物膜也发生相应改变。空白对照组中生物膜厚度为68 nm；在浓度为10.08 mg/mL芍药汤作用下，生物膜厚度为22 nm；在浓度为20.15 mg/mL芍药汤作用下，生物膜厚度为12 nm；在浓度为40.3 mg/mL芍药汤作用下，生物膜厚度为10 nm。结果表明，芍药汤浓度越高对白念珠菌生物膜破坏性越强。

图1在SEM下观察芍药汤对白念珠菌的形态影响

注：A.空白对照组；B.芍药汤浓度为10.08 mg/mL;C.芍药汤浓度为20.15 mg/mL;D.芍药汤浓度为40.3 mg/mL。

图2 LSCM下白念珠菌生物膜形态变化

注：A.空白对照组；B.芍药汤浓度为10.08 mg/mL;C.芍药汤浓度为20.15 mg/mL;D.芍药汤浓度为40.3 mg/mL。

3.4芍药汤干预白念珠菌生物膜形成结果

根据白念珠菌生物膜的不同生长阶段，设置5个观察时间点（2、6、12、24、48 h）评估芍药汤对白念珠菌生物膜代谢活性的抑制作用。通过吸光度（OD490nm）表示生物膜的代谢活性，构建芍药汤浓度与OD490nm的关系曲线，表明芍药汤抑制白念珠菌生物膜具有浓度依赖性。OD49nm值首次大幅降低拐点被定义为诱导白念珠菌生物膜代谢活性显著降低的最小抑菌浓度，在生物膜形成的早期阶段（2～12 h），最小抑菌浓度表现出显著变化。相反，在生物膜成熟阶段（24～48 h），芍药汤浓度趋于稳定，表明芍药汤对成熟阶段的生物膜表现出更强的抑制作用。见图3、图4。

通过计算所有芍药汤浓度下的OD490nm平均值及其标准差，进一步分析各时间点白念珠菌生物膜的整体代谢活性。在早期生物膜生长阶段（2～12 h），芍药汤对生物膜的整体代谢活性表现出显著的抑制作用（P<0.05），然而在后期（12～48 h）这种抑制效果没有表现出统计学差异性（P>0.05）。结果表明，芍药汤对白念珠菌生物膜的整体代谢活性的抑制作用呈下降趋势。2～12 h芍药汤对整体代谢活性抑制作用显著，12～48 h作用效果趋于平稳。见表1。

图3芍药汤对白念珠菌生物膜厚度的影响

图4运用XTT减低法评估不同浓度芍药汤对白念珠菌生物膜抑制的代谢活性

表1在各时间点芍药汤对生物膜的整体代谢活性抑制作用

3.5白念珠菌生物膜形成的不同阶段对芍药汤的敏感性结果

通过吸光度评估在不同浓度芍药汤的作用下，各时间点白念珠菌生物膜形成的代谢活性，总体呈下降趋势，在6～48 h，含芍药汤的实验组与空白对照组比较，对生物膜的形成具有显著抑制作用（P<0.05），然而在2 h时，实验组与空白对照组并未显示出统计学上的显著差异（P>0.05）。结果表明，在6～48 h随着芍药汤浓度升高，对白念珠菌生物膜生成的抑制作用增强，相比之下，在2 h内未见明显变化。随着白念珠菌培养时间延长，生成生物膜的代谢活性不断升高。相较于2 h生物膜代谢活性，6～48 h时间点生物膜活性均显著增加（P<0.05），最高可达2 h生物膜代谢活性的29倍，但在芍药汤的抑制作用下48 h生物膜代谢活性仅为2 h的6倍。此外，24 h生物膜代谢活性相比于48 h的无明显统计学差异（P>0.05）。结果表明，芍药汤干预白念珠菌生物膜生成，作用于成熟阶段。见图5。

图5在5个时间点中诱导白念珠菌生物膜代谢活性显著降低的最小抑菌浓度值

3.6结晶紫染色测定法与XTT减低法对白念珠菌生物膜活性及定量的比较结果

结果表明，随着芍药汤浓度升高，其对白念珠菌生物量清除作用增强，并且XTT减低法和结晶紫染色测定法对白念珠菌生物膜测定的结果无统计学意义（P>0.05）。说明XTT减低法与结晶紫染色法评估生物膜代谢活性及定量具有一定的相关性。见图6、图7。

图6运用XTT减低法评估不同浓度芍药汤对白念珠菌生物膜生成活性的抑制作用

图7运用结晶紫测定法评估不同浓度芍药汤对白念珠菌生物膜生成量的清除效果

4、讨论

在本研究中，证实芍药汤具有显著的抗念珠菌活性及抑制白念珠菌生物膜形成作用。在SEM的观察下发现，随着芍药汤浓度增加菌丝细胞数量减少，且细胞表面粗糙，细胞膜受损，细胞内容物泄漏。通过CLSM进一步证实，芍药汤通过抑制酵母相细胞转化为菌丝相细胞，促进白念珠菌细胞的分散，最终削弱念珠菌生物膜空间结构，抑制生物膜的形成。根据CLSM三维重建结果表明，在浓度为40.3 mg/mL芍药汤的作用下生物膜增厚，这可能与细胞外基质的改变有关，通过增强细胞外基质对白念珠菌生物膜产生保护，形成团聚现象。研究发现，抑制念珠菌生物膜的最低氟康唑浓度是抑制悬浮念珠菌MIC值的66～512倍，芍药汤抑制白念珠菌生物膜的活性仅为浮游状态下白念珠菌的5倍左右[10]。此外，从皮肤黏膜念珠菌病患者中分离的2株念珠菌，其SMIC50与白念珠菌标准菌株（ATCC90028)SMIC50值相近，表明芍药汤也有应用于临床的可能。根据白念珠菌生物膜生长发育阶段，发现随着芍药汤药物作用时间的延长，药物对白念珠菌生物膜生成活性的抑制作用增强，在24～48 h生物膜生成活性无明显增加，表明对成熟的白念珠菌生物膜具有显著的抑制作用。但是在2 h内未见明显抑制作用，可能作用机制与白念珠菌生物膜不同生长阶段的代谢特性有关。在生物膜形成的初始阶段，生物膜生成的代谢活性不稳定且逐步升高，但随着药物作用时间的延长，生物膜逐渐成熟，其代谢水平趋于稳定，芍药汤表现出强效且稳定的抑制效果。因此，芍药汤在白念珠菌成熟阶段的抑制作用最强。本研究中XTT测定方法和结晶紫染色法显示出相关性，可能与芍药汤作用于白念珠菌生物膜的成熟阶段有关。在生物膜成熟时期，细胞形成多层结构，并积累大量的外基质，此时生物膜的总体生物量较大，且细胞间紧密交互作用，代谢活性也较强。因此，在综合评估生物膜特性的时候，2种测定方法可相互补充。

中药比单分子西药具有更多的作用靶点，在抗菌作用的同时还具备调节免疫、改善机体微环境的作用。芍药汤中多为苦寒清热药物，主要用于治疗热性疾病，在临床广为应用于感染性和免疫性胃肠道疾病，包括阿米巴痢疾、溃疡性结肠炎、细菌性痢疾、过敏性结肠炎等，同时对真菌感染性疾病也产生影响。念珠菌感染患者常有手术外伤史或处于免疫抑制状态，机体正气不足，脏腑功能失调，阴阳失衡，阳盛阴虚，外加邪气入侵，造成久病生热等问题，故清除体内热毒、调整机体气血平衡、扶助正气是中医治疗的主要方面。芍药汤可清热解毒、抑肝扶正、调和气血，达到治病效果。从分子机制上来讲，芍药汤中含有白芍苷、甘草酸苷可激活蛋白酶、促进巨噬细胞活性、增强机体特应性免疫及非特应性免疫功能，故治以扶正祛邪，标本同治[11-14]。但中医药也存在一定的局限性，许多中药在体外试验中表现出良好的抗菌活性，但多种中药在动物模型试验或是临床上出现不一致的疗效，使得中药在抗真菌治疗中面临着巨大的挑战，可能的原因是中药饮片中含有的活性化合物含量偏低，需要现代化的制药技术解决此类难题[15-16]。需要注意的是抗真菌类中药多属于清热剂，长期服用苦寒类药物易伤脾胃，不适用于寒性体质或脾胃虚寒的人群。

参考文献:

[13]任伟钰,郑宜鋆,张月梅,等.当归多糖药理作用的研究进展[J].时珍国医国药, 2020, 31(10):2484-2487.

文章来源:邓晨薇,占萍,田玉,等.芍药汤对白念珠菌生物膜体外抑制活性研究[J].江西中医药大学学报,2024,36(04):95-101.