口腔鳞状细胞癌(OSCC)是常见的恶性肿瘤之一，好发于头颈部，通常被发现已经是晚期，其发病率和死亡率均处于上升趋势[1]。目前放射治疗是有效的手段之一，研究证明，放射治疗对患者的局部癌症进行控制，且提高患者的无病生存期，但大部分OSCC患者对放射治疗有一定的抵抗情绪[2]。肿瘤细胞的放射抵抗是导致肿瘤放射治疗失败的主要因素，进而让肿瘤细胞发生转移和复发，严重导致患者死亡[3]。因此，清楚引起口腔鳞状细胞癌放射治疗抵抗的机制对发展更有效的治疗策略，从而使患者得到更大的受益更有意义。热休克因子(HSF)1可保护蛋白质组，阻止对蛋白质组出现的错误折叠和聚焦，对蛋白质毒性应激有一定抵抗作用[4]。研究发现，HSF1介导癌细胞转化和癌细胞的存活，调节肿瘤细胞的迁移、自噬和代谢等生物学活性[5]。研究发现，在多种恶性肿瘤中HSF1表达升高，且可激活基质成纤维细胞，对肿瘤的微环境有重塑作用，进而对肿瘤的侵袭和迁移有一定促进作用。但目前关于口腔鳞状细胞癌中HSF1表达还不是十分明确[6]。转化生长因子(TGF)-β1可为肿瘤提供良好的生长环境供肿瘤生长和转移，对血管生成、免疫抑制剂合成细胞外基质有一定的促进作用[7]。Smads家族可正向或负向调节TGF-β1/Smad信号通路，进而保持TGF-β信号通路的平衡[8]。研究发现，Smads家族在肿瘤的发生发展中表达失调，进而破坏该信号通路的平衡，进而使细胞发生恶化[9]。Smad7是Smad是信号通路中的抑制因子，其和TGF-β1高表达于多种肿瘤细胞中，如结直肠癌、宫颈癌等，且TGF-β1在OSCC中也表现为高表达[10]。本研究探讨HSF1在OSCC肿瘤进展中的作用及其对TGF-β/Smad信号通路的影响。

1、材料与方法

1.1细胞株

正常人口腔上皮细胞HOEC和人口腔鳞状细胞癌SCC-9细胞购自上海细胞资源中心。

1.2试剂与仪器

HSF1 shRNA慢病毒悬液、阴性慢病毒悬液(美国Abcam公司);鼠抗人TGF-β1单克隆抗体(ab27969)、鼠抗人Smad7单克隆抗体(ab55493,德国Miltenyi Biotec公司);RPMI1640培养基(批号：A4192301)、胎牛血清(批号：1982158C,Gibco公司);噻唑蓝(MTT,批号：M8108)、胰酶(批号：T1350,北京索莱宝公司);NP-40细胞裂解液(上海碧云天公司);荧光倒置显微镜、透射电镜(日本Olynpus公司)。

1.3细胞培养

把正常人口腔上皮细胞HOEC和人口腔鳞状细胞癌SCC-9细胞复苏，培养HOEC细胞和SCC-9细胞于含胎牛血清的培养基中，加入100μg/ml链霉素和100μg/ml青霉素以防止细菌污染，继续培养细胞，保持培养箱温度为37℃,操作均在无菌条件下进行。细胞培养液2 d更换1次，待细胞贴壁长满瓶底时消化，取对数生长细胞。

1.4放疗抵抗细胞株SCC-9R的构建

将培养好的SCC-9细胞取出，用计量为2 Gy/min的6MV-X射垂直放疗细胞，放疗时长为24 h,待放疗结束后将细胞置于培养箱中继续培养。弃掉低剂量处理SCC-9细胞的培养基，将新鲜的DMEM培养基加入细胞中培养，细胞活力正常且未出现明显死亡，选择培养好的细胞增加放疗剂量继续培养细胞，直至该细胞在6 Gy射线下稳定存活，即构建成功放疗抵抗细胞株SCC-9R。

1.5细胞转染和分组

取出进入对数生长期的SCC-9/SCC-9R细胞，消化细胞，接种SCC-9/SCC-9R细胞于6孔板内，待细胞融合度为80%以上，弃掉细胞培养液，将无血清的培养基加入细胞中继续培养，转染细胞用LipofectamineTM2000进行，步骤按试剂盒操作。

本实验将人口腔鳞状细胞癌SCC-9/SCC-9R细胞分为3组，空白组：单纯的SCC-9/SCC-9R细胞不做任何处理；阴性慢病毒(NC)组：将SCC-9/SCC-9R细胞中转染阴性慢病毒悬液；转染(HSF1)组：将SCC-9/SCC-9R细胞中转染HSF1 shRNA慢病毒悬液，继续培养细胞。

1.6实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HOEC和SCC-9细胞中HSF1表达

取对数生长的HOEC和SCC-9细胞，裂解细胞提取总RNA,检测细胞中总RNA浓度。将RNA反转录成为cDNA,合成后的cDNA可直接用于PCR,将获得的PCR放置在-20℃环境中保存。本文对HSF1进行检测，内参为GAPDH,引物序列为：HSF1正向：5′-GCCAGTTTGCCAAGGAGGT-3′,反向：5′-TGTCGTC TCTCTCTGGCTTGAC-3′;GAPDH正向：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,反向：5′-GAGATGGTGATGGGATTTC-3′。反应条件：95℃30 s, 95℃5 s,共循环40次，60℃34 s。每个实验独立重复3次，采用2-ΔΔCt法检测。

1.7克隆形成实验检测细胞的克隆形成

将放疗后的细胞接种于6孔板内，培养细胞2 w,清晰可见细胞出现克隆，停止培养细胞并洗涤细胞并干燥，用4%多聚甲醛溶液固定细胞半小时，用结晶紫对细胞进行染色处理10 min,洗涤细胞，自然干燥细胞，计算细胞克隆数量(>50个细胞的为1个克隆)。

1.8 Transwell小室检测细胞侵袭

将Transwell小室放入24孔板内，接种转染阴性和HSF1 shRNA慢病毒24 h后的SCC-9或SCC-9R细胞悬液100μl,在培养箱中培养SCC-9或SCC-9R细胞12 h,擦拭微孔膜上室的细胞，PBS冲洗上室，4%多聚甲醛固定侵袭并黏附到小室微孔膜下面的细胞30 min,将细胞用结晶紫染色，磷酸盐缓冲液(PBS)再次冲洗小室，后置于显微镜下观察，计算穿模细胞数量。

1.9流式细胞仪检测细胞凋亡

将培养好的SCC-9/SCC-9r细胞取出，PBS清洗后加入500μl 1×结合缓冲液、5μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(AnnexinⅤ-FITC)及2.5μl碘化丙啶(PI),充分混合均匀，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.10 Western印迹检测细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达

取对数生长的SCC-9或SCC-9R细胞，用胰蛋白酶消化SCC-9或SCC-9R细胞，制成细胞悬液。离心SCC-9或SCC-9R细胞悬液，重悬细胞后再次离心SCC-9或SCC-9R细胞，收集细胞上清液，保存于-80℃环境。将十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液加入蛋白样品中，加热5 min至蛋白质变性，将样品加入至样孔中并电泳。将蛋白样品转移并清洗，将其放置在TBST溶液中室温下混匀10 min,样品用脱脂奶粉进行封闭，1 h后取出并于4℃环境孵育样品过夜。将抗体分别加入样品中，洗涤样品后用凝胶成像系统成像曝光，进一步分析。

1.11统计学分析

采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、t检验，用GrapgPabd Prism7软件对实验数据进行相关图片的绘制。

2、结 果

2.1细胞和放疗抵抗细胞中HSF1表达比较

HSF1在正常人口腔上皮细胞HOEC中表达较低，与HOEC细胞(0.13±0.02)相比，人口腔鳞状细胞癌SCC-9细胞(1.21±0.08)和抵抗细胞SCC-9R细中HSF1表达(1.45±0.10)显著增加，且抵抗细胞SCC-9R中HSF1表达明显高于SCC-9细胞(均P<0.05)。

2.2 SCC-9/SCC-9R细胞中HSF1表达比较

HSF1组SCC-9/SCC-9R细胞中HSF1表达(0.43±0.05、0.68±0.07)明显低于空白组(1.00±0.10、1.00±0.11,均P<0.05);与NC组(1.02±0.11、1.05±0.12)比较，HSF1组SCC-9/SCC-9R细胞中HSF1表达明显降低(均P<0.05);空白组和NC组细胞中HSF1表达无明显差异(P>0.05)。

2.3细胞侵袭能力比较

空白组和NC组SCC-9和SCC-9R细胞的侵袭能力无显著差异(P>0.05);HSF1组SCC-9和SCC-9R细胞的侵袭能力较空白组和NC组显著降低(均P<0.05),见图1。

图1各组细胞侵袭能力(结晶紫染色，×200)  

2.4各组TGF-β1、Smad7蛋白表达比较

空白组和NC组SCC-9和SCC-9R细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达无显著差异(P>0.05);HSF1组SCC-9及SCC-9R细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达显著低于空白组和NC组(均P<0.05),见表1、图2、图3。

2.5细胞克隆形成实验比较

空白组和NC组SCC-9、SCC-9R细胞克隆形成数无明显差异(P>0.05);HSF1组SCC-9和SCC-9R细胞克隆形成数较空白组和NC组显著减少(均P<0.05),见表1、图4。

2.6细胞凋亡能力比较

空白组和NC组SCC-9、SCC-9R细胞凋亡能力无显著差异(P>0.05);HSF1组SCC-9和SCC-9R细胞凋亡能力明显优于空白组和NC组(均P<0.05),见表1、图5。

表1各组SCC-9/SCC-9R细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达、细胞克隆形成数及凋亡能力比较(x¯±s,n=6)

图2各组SCC-9细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达 

图3各组SCC-9R细胞中TGF-β1、Smad7蛋白表达 

图4各组细胞克隆(结晶紫染色，×200)

图5流式细胞仪检测各组细胞凋亡  

3、讨 论

OSCC是目前临床常见的一种恶性肿瘤，虽然随着科学的发展治疗技术不断地进步，但患者5年内的生存率仍很低，且OSCC的复发和转移也会很大程度增加患者的死亡率[11]。放射治疗可很大程度对OSCC的复发和转移进行预防，但OSCC对放疗的抵抗往往造成治疗的失败[12]。有文献显示，癌症中的HSF1可驱动一个不同于经典热休克反应的转录程序，对核心细胞功能网络进行协调，进而对肿瘤细胞的恶性表达进行支持[13]。有数据显示，HSF1可对多种肿瘤的不良预后进行有效反应，且其在肿瘤细胞中的高表达介导肿瘤细胞的转移、发生、发展。研究发现，HSF1的异常高表达与患者的不良预后密切相关，是口腔鳞状细胞癌独立预后因子。

本研究结果提示，HSF1的表达水平与乳腺癌放疗抵抗可能存在调控关系。癌细胞的侵袭能力是决定其转移速度的重要因素之一，细胞凋亡/自噬异常可导致癌细胞疯狂生长[14,15]。本研究结果显示，沉默HSF1可显著抑制SCC-9R细胞的侵袭和促进细胞对放射性的敏感性和凋亡，提示沉默HSF1表达可逆转SCC-9R的放疗抵抗作用，增加放疗抵抗SCC-9R细胞的放疗敏感性。HSF1是HSF家族中的成员之一，它是一种应力诱导的转录因子，是最主要的热休克调控因子，在不同物种中结构高度保守。HSF1介导的热休克反应能保护细胞免受环境或细胞内应激引起的损伤，介导恶性肿瘤的发生、发展。HSF1不仅能对肿瘤中的热休克蛋白表达一定程度的增加，而且对肿瘤细胞的恶性行为也有更加直接、广泛的调控作用。在癌细胞中HSF1通过调节HSP的表达、细胞代谢、细胞增殖、抗凋亡、EMI、迁移、侵袭等在癌症中发挥重要作用，是治疗人类癌症的潜在靶点[16]。

TGF-β最早被称为肉瘤生长因子，其包括3中类型，TGF-β1是最常见的形式之一[17]。研究发现，多种细胞均可分泌泌出TGF-β1,其刚从胞质中分泌出时是以无活性的大分子蛋白前体形式存在，其分泌到细胞外后被多种因素激活，进而发挥生物学效应。有文献显示，TGF-β1在多种恶性肿瘤中高表达，介导肿瘤的发生、发展，例如结直肠癌、宫颈鳞癌等[18]。本实验结果显示，沉默HSF1可抑制SCC-9和SCC-9R细胞中TGF-β1的蛋白表达。Smads作为一种重要的中介分子，可使TGF-β1信号转导通路中的相关因子从细胞质进入细胞核内。Smads家族可根据功能不同分为3种类型，包括R-Smads、Co-Smads和I-Smads,其中Smad7属于第3种类型。研究发现，Smad7在胃癌发生淋巴转移的患者中高表达，介导胃癌患者的预后[19]。在胰腺癌中也有类似的报道，Smad7在胰腺癌中为高表达，MiR-487a-3p通过靶向Smad7信号通路可抑制胰腺癌细胞活性，促进其凋亡，说明Smad7参与肿瘤的进展[20]。本研究结果提示，沉默HSF1可抑制口腔鳞状细胞癌放射抵抗细胞中的TGF-β1、Smad7表达。于烁等[21]研究发现，口腔鳞状细胞癌患者组织中TGF-β1、Smad7呈高表达，并且可根据TGF-β1、Smad7表达来判断口腔鳞状细胞癌预后情况。

综上，沉默HSF1可抑制口腔鳞状细胞癌中TGF-β1、Smad7表达，可逆转放疗抵抗口腔癌细胞对放疗的抵抗作用，增加放疗敏感性。

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文章来源:魏丛丛,郭冲冲,岳黎.沉默HSF1基因诱导TGF-β/Smad信号通路对口腔癌细胞放疗抵抗的作用机制[J].中国老年学杂志,2023,43(13):3286-3291.