首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 口腔肿瘤论文 > miR-485-5p靶向RAPTOR影响口腔鳞状细胞癌迁移、侵袭和增殖

miR-485-5p靶向RAPTOR影响口腔鳞状细胞癌迁移、侵袭和增殖

2024-05-26 91 上传者：管理员

摘要：目的:探讨mTOR调节相关蛋白(regulatory-associated protein of mTOR, RAPTOR)对口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)迁移、侵袭和增殖能力的影响。方法:利用TCGA生物信息数据库查询在头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)组织与癌旁组织中差异表达的mRNA。Western blot检测RAPTOR在人口腔上皮细胞HOEC和OSCC细胞系中的表达。利用伤口愈合实验、Transwell实验、EdU实验检测各组细胞迁移、侵袭及增殖能力。生物信息学网站预测与RAPTOR靶向结合的微小RNA(microRNA,miR)。功能学实验验证miR-485-5p是否可以靶向RAPTOR影响OSCC细胞的迁移、侵袭和增殖。结果:RAPTOR在HNSCC组织中较癌旁组织表达增高。伤口愈合、Transwell和EdU实验结果示，RAPTOR有促进OSCC细胞的迁移、侵袭和增殖能力。miR-485-5p能与RAPTOR靶向结合，且miR-485-5p上调能逆转RAPTOR促进CAL27细胞迁移、侵袭和增殖能力。结论:miR-485-5p通过靶向RAPTOR抑制OSCC细胞迁移、侵袭和增殖能力。

关键词：
HNSCC
mTOR调节相关蛋白
OSCC
口腔鳞状细胞癌
微小RNA-485-5p
加入收藏

头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)是最常见的恶性肿瘤之一，其中口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)占40%,是HNSCC中最主要的类型[1,2]。全球每年OSCC约有30万新发病例和10万死亡病例，发病率占罹患癌症总人口的2%,死亡病例占患癌死亡人数的1.9%[3,4]。OSCC晚期患者由于远处转移、肿瘤复发等情况而使5年生存率不足60%[5]。因此，探究OSCC发生、发展的分子机制，寻找新的OSCC分子治疗靶点，对OSCC的治疗具有积极意义。

mTOR调节相关蛋白(regulatory-associated protein of mTOR, RAPTOR)可与mTOR在细胞内形成mTOR复合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1,mTORC1),在细胞生长、调节脂质和蛋白质代谢方面发挥重要作用[6]。研究表明mTOR信号通路可调节胶质瘤、肝癌和结直肠癌等多种癌症细胞迁移、侵袭能力，并与癌症的靶向治疗密切相关[7,8,9,10],且该通路的激活和异常传导可促进OSCC细胞的迁移和增殖[11]。RAPTOR在人乳头瘤病毒相关的口咽鳞状细胞癌患者及细胞系中表达较高，且RAPTOR下调可抑制卵巢癌细胞的迁移能力[12,13],但RAPTOR对OSCC的迁移、增殖和侵袭的影响尚未有深入研究。因此，本实验将研究RAPTOR对OSCC迁移、增殖和侵袭的影响，并预测其靶向结合基因，验证基因靶向RAPTOR在OSCC细胞中发挥的作用，为寻找OSCC可能存在的分子治疗靶点提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 实验材料

人口腔上皮细胞HOEC(北京北纳创联生物技术研究院);HEK293T(美国典型培养物保藏中心);人OSCC细胞系HN30、HN4和CAL27(上海市口腔颌面部肿瘤组织样本及生物信息数据库专业技术服务平台)。EdU检测试剂盒(碧云天生物技术，上海);Transwell小室(康宁公司，美国);人抗兔RAPTOR单克隆抗体、人抗兔β-actin单克隆抗体(Abcam, 英国);荧光素酶报告基因载体(普罗麦格，美国);RAPTOR干扰及对照质粒、过表达及对照质粒和miR-485-5p抑制及对照质粒、过表达及对照质粒(上海吉凯基因医学科技股份有限公司，上海);Lipofectamine2000转染试剂(Invitrogen公司，美国)。

1.2 生物信息学数据库

通过癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas, TCGA)查找HNSCC组织和癌旁组织中差异表达的mRNA。StarBase数据库分析RAPTOR在HNSCC组织和癌旁组织中差异表达。以“OSCC”、“miRNA”为关键词在基因表达数据库(gene expression omni-bus, GEO)获取数据集GSE28100,获得在OSCC中差异表达的miRNA。使用miRwalk 和Targetscan 获取与RAPTOR可能有靶向结合关系的miRNA。在线韦恩图绘制网站将获取的miRNA绘制韦恩图取交集。利用Starbase数据库查询miR-485-5p在HNSCC的差异表达情况。

1.3 细胞培养

CAL27、HN4、HN30细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，HOEC细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%CO2的培养箱中培育。

1.4 Western blot实验

应用RIPA细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白，二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid Assay, BCA)检测试剂盒测定蛋白浓度。聚丙烯凝胶电泳分离蛋白，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)转膜，脱脂奶粉封闭1 h, 一抗4 ℃孵育过夜，Tris-Buffered Saline and Tween 20(TBST)洗3次，二抗室温孵育1 h, 增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence, ECL)化学凝胶系统曝光，通过Image J软件分析灰度值。Western blot一抗浓度：β-肌动蛋白(β-actin)(1∶5000);RAPTOR(1∶1000)。

1.5 细胞转染

待细胞生长密度至80%融合时，使用Lipo-fectamine2000将不同质粒转染入CAL27细胞，分组：(1)si-RAPTOR和si-NC组：分别转染干扰RAPTOR表达质粒和对照质粒。(2)ov-RAPTOR和ov-NC组：分别转染RAPTOR过表达质粒和对照质粒。(3)in-miR-485-5p和in-con组：分别转染抑制miR-485-5p表达质粒和对照质粒。(4)in-miR-485-5p+si-NC组：同时转染抑制miR-485-5p表达质粒和干扰RAPTOR表达质粒的对照质粒。(5)in-miR-485-5p+si-RAPTOR组：同时转染抑制miR-485-5p表达质粒和干扰RAPTOR表达质粒。(6)ov-miR-485-5p和ov-con组：分别转染miR-485-5p过表达质粒和对照质粒。(7)ov-miR-485-5p+ov-NC组：同时转染miR-485-5p过表达质粒和RAPTOR过表达质粒的对照质粒。(8)ov-miR-485-5p+ov-RAPTOR:同时转染miR-485-5p过表达质粒和RAPTOR过表达质粒。

1.6 Transwell实验

将各组含有4×104个细胞的细胞悬液200 μL加入到Matrigel基质胶小室的上室，下室加入500 μL胎牛血清。24 h后，甲醇固定小室20 min, PBS洗涤3次，吉姆萨染液染色40 min, 于光学显微镜(×40)下随机选取不同区域拍照并计数。

1.7 EdU增殖实验

待各组细胞在24孔板玻片中生长密度达80%,加入EdU工作液，37 ℃培养箱中孵育2 h后弃液，PBS洗涤3次，多聚甲醛固定30 min, 0.2%Triton透膜20 min, 每孔加入Click反应液避光孵育30 min。4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)行细胞核染色。于正置荧光显微镜(×40)下随机选取不同视野拍照并计算阳性比率。

1.8 伤口愈合实验

将各组含有8×104个细胞的细胞悬液均匀接种至6孔板中，待细胞密度生长至70%,更换2%胎牛血清DMEM培养基，进行划痕，于0 h、24 h后于显微镜(×20)下随机选取不同区域拍照。

1.9 双荧光素酶报告基因实验

构建RAPTOR野生型(pGL3-RAPTOR-3’-UTR-WT)和突变型(pGL3-RAPTOR-3’-UTR-MUT)质粒，miR-485-5p过表达及对照质粒共转染293T细胞，48 h后，PLB裂解细胞15 min, 收集裂解液行荧光素酶活性测定。

1.10 统计学方法

应用SPSS 23.0统计软件分析数据，实验数据均用表示。两组间比较采用t检验。多组间比较采用F检验，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 RAPTOR在HNSCC癌组织和OSCC细胞系中高表达

对TCGA生物信息学数据库进行泛癌分析，RAPTOR在多种癌组织中表达水平有较大差异(图1a),以adj.P<0.05和logFC>0.5/1作为筛选条件，进一步确定RAPTOR差异表达(图1b)。Starbase在线网站分析RAPTOR在497例HNSCC组织和44例癌旁组织中表达，显示RAPTOR在癌组织较癌旁组织中高表达(P<0.01)。Western blot结果显示，RAPTOR在HN4、HN30和CAL27细胞中相对表达量分别为3.10±0.56、2.13±0.28和5.10±0.11,尤其在CAL27中表达最高，均显著高于HOEC(图1c)。后续本研究选择CAL27细胞作为实验细胞系。

图1RAPTOR在HNSCC组织和OSCC细胞系中差异表达

图2 RAPTOR促进CAL27细胞迁移、增殖和侵袭

2.2 RAPTOR促进CAL27的迁移、侵袭和增殖

Western blot实验检测RAPTOR干扰质粒、对照质粒和过表达质粒转染效果。si-RAPTOR组RAPTOR相对表达量为0.47±0.05,较si-NC组低，而ov-RAPTOR组为1.39±0.14,较ov-NC组高(图2a),表明转染成功。Transwell实验结果显示si-RAPTOR组中穿过基底膜细胞的数量少于si-NC组，ov-RAPTOR组较ov-NC组穿过基底膜细胞数量多(图2b, 表1)。EdU实验结果显示，si-RAPTOR组细胞阳性率较si-NC组降低，ov-RAPTOR组细胞增殖率较ov-NC组增高(图2c, 表1)。伤口愈合实验结果显示，si-RAPTOR组细胞较si-NC迁移率降低，ov-RAPTOR组迁移率较ov-NC组升高(图2d, 表1)。以上结果表明在CAL27中转染干扰RAPTOR质粒降低了细胞迁移、侵袭和增殖能力，转染过表达RAPTOR质粒可以增强细胞的迁移、侵袭和增殖能力。

表1 RAPTOR对OSCC细胞迁移、增殖和侵袭的影响

2.3 RAPTOR可与miR-485-5p靶向结合

GSE28100数据集以adj.P<0.05,logFC<0为筛选阈值，火山图示差异表达的miRNA(图3a),利用在线数据库miRwalk、Targetscan, 获得12个可能与RAPTOR存在结合位点且在OSCC癌组织中呈差异表达的靶向miRNA,通过查询Starbase数据库选择表达差异可信度最高miR-485-5p为进一步研究对象(P<0.01,图3b)。双荧光素酶报告实验显示RAPTOR与miR-485-5p之间存在结合位点(图3c)。Western blot结果显示，抑制miR-485-5p表达，RAPTOR相对表达量为1.78±1.77,较in-con组高。过表达miR-485-5p后，RAPTOR相对表达量为0.47±0.18,较ov-con组降低(图3d)。综上所述，RAPTOR与miR-485-5p之间可能存在靶向结合关系。

2.4 miR-485-5p靶向RAPTOR抑制CAL27细胞迁移、侵袭和增殖

将in-miR-485-5p、si-RAPTOR质粒，ov-miR-485-5p、ov-RAPTOR质粒共转染CAL27细胞。伤口愈合实验结果可见， in-miR-485-5p组细胞迁移能力增强，但与si-RAPTOR质粒共转染后可逆转促进作用(图4a, 表2)。EdU结果显示，抑制miR-485-5p表达可促进CAL27增殖，干扰RAPTOR表达后逆转对CAL27增殖促进作用；ov-miR-485-5p组细胞增殖能力减弱，并逆转RAPTOR过表达后CAL27增殖的促进作用(图4b, 表2)。Transwell侵袭实验结果表明，抑制miR-485-5p表达后细胞侵袭能力增强，干扰RAPTOR表达后逆转对细胞增殖能力的促进作用；miR-485-5p过表达可逆转过表达RAPTOR对细胞增殖能力的促进作用(图4c, 表2)。综上所述，miR-485-5p可以靶向RAPTOR抑制OSCC细胞的迁移、侵袭和增殖。

图3 RAPTOR与miR-485-5p靶向结合

表2 miR-485-5p靶向RAPTOR抑制OSCC细胞的迁移、侵袭和增殖

图4 miR-485-5p靶向RAPTOR抑制OSCC细胞的迁移、侵袭和增殖能力

3、讨论

OSCC仍是当今威胁人民生命健康的重要疾病，因口腔解剖结构及解剖位置的特殊性，易复发及发生淋巴结转移[14]。RAPTOR作为mTORC1的亚基，参与包括蛋白质合成、葡萄糖代谢、细胞增殖等多种生理及病理过程[15],但RAPTOR对于OSCC的发生发展影响鲜见报道。本实验结果证明RAPTOR在OSCC中发挥促癌基因的作用，促进OSCC细胞的迁移、增殖和侵袭。

miRNA是一类21～22个核酸长度非编码RNA,通常通过靶向mRNA影响基因表达[16]。已有研究表明，miRNA在肺癌[17]、乳腺癌[18]等多种肿瘤的发生发展中起重要作用。在OSCC中，大量miRNA存在异常表达，并影响OSCC的发生发展，如miR-302b通过靶向卷曲同源物6(recombinant frizzled homolog 6,FZD6)抑制OSCC的侵袭和迁移[19],miR-101靶向转化生长因子β受体Ⅰ(transforming growth factor beta receptor 1,TGF-βR1)抑制OSCC的增殖和迁移[20]。本文中筛选出的miR-485-5p已被证实能影响多种癌症迁移、侵袭和增殖能力，过表达miR-485-5p可以抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移，并促进细胞凋亡[21]。然而miR-485-5p对OSCC迁移、增殖和侵袭的影响尚未见报道。本研究通过生物信息学方法，预测miR-485-5p可与RAPTOR靶向结合，通过伤口愈合实验、Transwell实验和EdU实验验证了miR-485-5p通过靶向RAPTOR抑制OSCC的迁移、增殖和侵袭，证实了miR-485-5p对OSCC发生发展的作用。

综上所述，RAPTOR在OSCC细胞系中高表达，miR-485-5p可以靶向RAPTOR从而抑制OSCC细胞的迁移、侵袭、增殖能力。未来本课题组将更深入研究miR-485-5p是否参与信号通路传导，及其影响OSCC发生、发展的机制，并进一步探究如何与临床应用相结合，为OSCC的治疗提供理论基础。

基金资助:山东省自然科学基金(编号:ZR202110190030);潍坊医学院附属医院种子基金(编号:2021wffyzzjj06);潍坊市科技发展计划项目(编号:2022YX029);

文章来源:陈嘉雯,丁啸,栾可峰,等.miR-485-5p靶向RAPTOR影响口腔鳞状细胞癌迁移､侵袭和增殖[J].口腔医学研究,2024,40(05):429-435.