糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease, DKD)是一种与糖尿病相关的代谢紊乱诱导的重要微血管病变，以肾小球过度滤过、进行性白蛋白尿、肾功能下降甚至进展为终末期肾病为临床表现[1],具有高发病率、难逆转性、预后不佳等特征[2]。现代医学认为，炎症、Kimmelstiel-Wilson结节、系膜弥漫性扩张、肾小管及肾小球基底膜增厚是DKD常见的病理表现[3,4]。西医治疗DKD强调多因素干预，运动、饮食、戒烟等生活习惯的调整，降糖降压控脂、阻断肾素-血管紧张素-醛固酮系统和新型临床药物的推广使用，如钠葡萄糖转运蛋白2抑制剂、胰高血糖素样肽-1激动剂以及盐皮质激素受体拮抗剂等，有助于预防和延缓DKD的进展，但长期服药影响肾功能[5]。中医治疗本病强调标本同治、整体施治、个体化原则，改善不适症状，提高生存质量[6]。目前，临床对DKD的研究集中在利用数据挖掘技术对医案处方及文献数据库进行用药经验总结，而针对“真实世界”DKD某一具体证型归纳其用药规律及作用机制较少。故本研究拟基于回顾性“真实世界”数据，分析中医药治疗湿热血瘀型DKD的用药规律及核心药物发挥药效的分子机制，以期为临床辨治以及新药研究提供方向和理论支持。

1、资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 资料来源

本研究的临床病历资料均来源于河南中医药大学第一附属医院、河南省中医院、河南中医药大学第三附属医院，基于住院电子病历系统收集2011年1月至2021年10月住院的湿热血瘀型DKD患者病案信息。

1.1.2 纳入标准

(1)符合DKD西医、中医诊断标准，西医诊断标准参考《中国2型糖尿病防治指南(2010年版)》[7]、《糖尿病肾脏疾病临床诊疗中国指南》[8];中医诊断标准参考《糖尿病肾病中医防治指南(2011版)》[9],且中医证型属于湿热血瘀证；(2)患者的病历资料信息记录完整者，如中医证候分型、中药复方及药物剂量等；(3)采用中药复方治疗者。

1.1.3 排除标准

(1)不符合上述中西医诊断标准及中医证型者；(2)临床病历数据收录的主要信息不完善者，如缺少中医证型、舌脉、方药等。

1.1.4 数据录入与整理

根据纳入、排除标准，提取出符合条件的湿热血瘀型DKD患者资料，双人双机独立使用Microsoft Excel 2016建立数据库。为避免纰漏，保证数据准确性，再由第3人进行数据复核。

1.1.5 规范化命名

(1)参考《中医药学名词》[10]、《中医临床诊疗术语》[11]对证候名称进行规范化命名；(2)参考《中华人民共和国药典(2020版)》[12]、《中华本草》[13]对中药名称进行规范化命名，对于异名同药的药物则规范为标准名称，如枸杞、杞果统一规范为枸杞子；对于不用的炮制方法但功效类似的中药则归属于同一药物，如姜半夏、法半夏统一规范为半夏。

1.1.6 数据分析

(1)频次分析：利用Microsoft Excel 2016对湿热血瘀型DKD患者所服用的中药复方进行药物频次、性味归经统计分析；(2)复杂网络社团结构分析：利用R语言中的复杂网络社团结构划分的贪心算法，直接优化模块化得分来寻找密集子图，绘制复杂网络社团结构网络图；(3)系统聚类分析：利用SPSS Statistics 26.0的组间连接方法，对前30味高频中药进行聚类分析；(4)因子分析：利用SPSS Statistics 26.0对前30味高频中药进行KMO和Bartlett球形检验，满足条件后进行因子分析；(5)关联规则分析：利用R语言的arules、arulesViz包进行关联规则分析。

1.2 网络药理学作用机制研究

1.2.1 核心药物活性成分筛选及靶点的预测

利用中药系统药理学数据库及分析平台(Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform, TCMSP)数据库进行核心药物的有效活性成分和潜在的作用靶点筛选，并利用UniProt数据库规范靶点名称。对于TCMSP数据库检索失败的中药，利用已发表的文献以及化学专业数据库进行补充。

1.2.2 “核心药物-活性成分-靶点”网络图的建立

通过Cytoscape 3.7.1软件建立“核心药物-活性成分-靶点”网络图，并利用Network Analyzer工具进行网络特征的分析，以研究活性成分与靶点及其之间的关系。

1.2.3 DKD靶点获取及韦恩图绘制

利用GeneCards数据库检索“Diabetic kidney disease”,取DKD靶点和核心药物靶点的并集，并绘制韦恩图。

1.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络的构建及核心靶点的筛选

将得到的DKD和核心药物的交集靶基因输入STRING数据库,构建PPI网络，利用Cytoscape 3.7.1软件制作PPI网络图，并通过Analyze Network工具进行拓扑学分析，借助介度中心性(betweenness centrality, BC)、接近中心性(closeness centrality, CC)、临近连通性(neighborhood connectivity, NC)和连接度(degree)4列数值，且每一列均设置为大于中位值，筛选核心靶基因。

1.2.5 基因本体(Gene Ontology, GO)功能、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析

将得到的DKD疾病和核心药物的交集靶基因导入Metascape数据库,对核心药物联合治疗DKD的交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，探究其相关靶点在功能与通路上的作用机制。

1.2.6 “药物活性成分-靶点-作用通路”网络图的构建

利用Microsoft Excel 2016软件，按两列分别构建“药物活性成分-靶点”“靶点-作用通路”的列表，将其导入Cytoscape 3.7.1软件中构建网络。

1.3 分子对接验证

制作药物-活性成分-交集靶点Excel表，导入cytoscape3.7.1软件进行拓扑学分析，筛选度值(Degree)排名靠前的药物活性成分；使用1.2.4中得到的PPI网络筛选度值(Degree)排名靠前的核心靶点。利用PubChem和RCSB PDB数据库(https: //www.rcsb.org/)分别获取药物活性成分和核心靶点蛋白的分子结构，先通过PyMOL软件进行核心靶点蛋白的处理，再导入AutoDock Tools 1.5.6软件进行分子对接，根据结合能(Affinity)的大小判断化合物与靶点结合能力大小，利用Discovery Studio 4.5软件对结果进行可视化展示。

2、结果

2.1 湿热血瘀型DKD用药规律分析结果

2.1.1 药物频次分析

本研究共纳入489例湿热血瘀型DKD患者资料，涉及的489首中药复方共有325味中药，常用中药依次是陈皮(312次)、黄连(269次)、茯苓(268次)、半夏(216次)、黄芪(194次),见表1。排名前5位的陈皮、黄连、茯苓、半夏、黄芪的剂量使用范围为3～20 g、6～15 g、10～50 g、6～15 g、15～40 g, 使用频次最多的剂量为15 g、15 g、30 g、9 g、30 g, 见图1。

图1 排名前5位的中药用量及使用频次分析图  

表1 湿热血瘀型DKD患者常用中药频次分析

2.1.2 性味归经分析

对325味中药的性味归经进行统计分析，治疗湿热血瘀型DKD用药多性味苦寒、入肝经，或性味甘温、入脾经为主，见图2。

图2 治疗湿热血瘀型DKD中药的性味归经统计图   

2.1.3 复杂网络社团结构分析

基于R语言贪心算法，对湿热血瘀型DKD所用中药进行复杂网络社团结构划分，并绘制复杂网络图，其中不同颜色代表不同的小社团，社团越大则所占的比重越大，见图3。

图3 治疗湿热血瘀型DKD中药网络社团结构划分图   

2.1.4 系统聚类分析

通过SPSS Statistics 26.0对湿热血瘀型DKD患者服用的高频中药进行系统聚类分析，并根据临床经验总结，结果聚为6类较为合理，分别是C1:黄连、竹茹、半夏、陈皮、茯苓、白术、丹参、大黄、厚朴、枳实；C2:水蛭、葛根；C3:苍术、黄柏、薏苡仁、黄芩；C4:甘草、泽泻；C5:川芎、红花；C6:赤芍、牛膝、桂枝、黄芪、当归、鸡内金、地龙、鸡血藤、知母、生地黄，见图4。

图4 湿热血瘀型DKD常用中药聚类分析谱系图   

2.1.5 因子分析

结果显示，KMO=0.652,Bartlett球形检验：χ2=2 124.588,df=435,P<0.001,满足因子分析的条件。然后利用主成分分析的方法，基于特征值>1、凯撒正态化最大方差法旋转提取出11个公因子，累积贡献率59.387%,见表2;绘制碎石图及旋转后的空间组件，见图5、图6。

表2 湿热血瘀型DKD患者常用中药因子分析

图5 因子分析碎石图   

图6 旋转后的空间组件图   

2.1.6 关联规则分析

利用R语言对湿热血瘀型DKD所用中药进行关联规则分析，设定提升度>1,参数置信度≥90%,支持度≥15%,共得到13组药物组合，根据置信度高低排序，常用药物组合是黄连-赤芍-陈皮-竹茹、陈皮-白术-竹茹、陈皮-赤芍-黄连-竹茹、黄连-赤芍-竹茹、陈皮-赤芍-竹茹，见表3。基于关联规则置信度、提升度以及各中药使用频次，“黄连-赤芍-陈皮-竹茹”为治疗湿热血瘀型DKD核心药物。

表3 湿热血瘀型DKD所用中药关联规则分析

2.2 “黄连-赤芍-陈皮-竹茹”核心药物治疗湿热血瘀型DKD的作用机制

2.2.1 核心药物活性成分及作用靶点的获取

通过TCMSP数据库以OB≥30%、DL≥0.18为条件，筛选获得黄连、赤芍、陈皮的活性成分。利用化学专业数据库和已发表的文献[14,15,16]筛选竹茹的活性成分，输入Pubchem数据库(https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取SMILES结构式和2D结构，导入Swiss ADME数据库，根据胃肠吸收(gatrointestinal absortion)结果为“HIGH”,且5种药物相似性指标(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)的结果中有2个及2个以上是“YES”为条件筛选活性化合物，将其2D结构导入Swiss Target Prediction数据库(http: //www.swisstargetprediction.ch/),研究物种设定为“Homo sapiens”,筛选出置信度(probability)>0的作用靶点。最终得到黄连活性成分14个，赤芍活性成分29个，陈皮活性成分5个，竹茹活性成分11个，排除未能找到靶点的成分后，共获得有效活性成分40个，作用靶点355个，见表4。

表4 黄连-赤芍-陈皮-竹茹的有效活性成分

2.2.2 “核心药物-活性成分-靶点”网络的构建

利用Cytoscape 3.7.1对核心药物及其活性成分和靶点的关系绘制网络图，分析得到399个节点(其中药物名称4个、有效活性成分40个、作用靶点355个)以及772条关系，见图7。

图7 核心药物-活性成分-靶点网络图  

利用Genecards疾病数据库检索到DKD靶点11 340个，筛选后获得1 147个靶点，核心药物与疾病的交集靶点为140个，见图8。

图8 核心药物-疾病交集靶点韦恩图   

2.2.4 PPI网络构建及核心靶点的筛选

利用STRING数据库建立核心药物治疗DKD的作用靶点PPI网络，导出文件后利用Cytoscape 3.7.1软件及其Network Analyzer插件进行拓扑分析，借助BC、CC、NC和degree 4项，每一项均大于中位值进行筛选，筛选条件为BC>0.001 79、CC>0.579 17、NC>64.289 62、degree>42.5,得到15个节点，即为核心靶点，见图9。

2.2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用Metascape平台对上述140个交集靶基因进行基因富集分析，GO功能富集分析得到生物过程(biological process, BP)1 936个，主要参与无机物反应、细胞迁移正调控、细胞运动正调控、多肽反应等；细胞组成(cellular component, CC)101个，主要集中于膜筏、膜微区、囊泡腔、膜侧等；分子功能(molecular function, MF)160个，主要参与细胞因子受体结合、蛋白酶结合、激酶结合、蛋白激酶结合等。分别以-lg P 由大到小排列，选取前10条做柱状图分析，见图10。KEGG通路富集分析得到201条信号通路，选取了包括癌症的通路、糖尿病并发症中的晚期糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体(advanced glycation endproduct-the receptor of advanced glycation endproducts, AGE-RAGE)信号通路、低氧诱导因子-1(hypoxic inducible factor-1,HIF-1)信号通路、磷脂肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)信号通路等20条相关通路进行气泡图分析，见图11。

图9 PPI网络核心蛋白筛选过程   

图10 核心药物治疗DKD作用靶点的GO富集分析柱状图   

图11 核心药物治疗DKD作用靶点的KEGG通路富集分析气泡图   

2.2.6 “药物成分-靶点-作用通路”网络的建立

利用Cytoscape 3.7.1软件构建“药物成分-靶点-作用通路”网络图，进行拓扑学参数分析后，按照度值高低调节节点在网络中的大小和透明度，见图12。其中，核心药物所含的共12种活性成分；靶点基因为核心药物所含成分直接作用且KEGG涉及的靶点基因共99个；作用通路为KEGG通路富集分析气泡图所选的20条通路。

2.2.7 分子对接验证

选取槲皮素、苜蓿素、4-羟基-3-甲氧基肉桂醛、二氢川陈皮素和黄芩素5个主要活性成分，分别与FOS、IFNG、MAPK8、IL-2、CASP8共5个DKD核心靶点进行分子对接验证，结果显示，分子与标靶蛋白的最低结合能均小于0,说明配体与受体均可以自发结合，见表5、图13。

图12 药物成分-靶点-作用通路网络图  

图13 药物活性成分和核心靶点的分子对接图   

表5 活性成分和核心靶点分子对接的结合能

3、讨论

3.1 中医药治疗湿热血瘀型DKD的用药规律分析

本研究基于“真实世界”数据挖掘的方法，总结中医药临床治疗湿热血瘀型DKD的用药规律。DKD属中医“消渴”范畴。先天五脏精气亏虚，加之平素嗜食酒肉肥甘之味，过度忧劳，牵连脾胃，运化通降功能失司，内蕴湿热，交结难消，耗伤气津，气血同源，气损则荣血不畅，脉道壅塞而致瘀，或气虚则血失固摄，溢于脉外，积久成瘀，津血同源，津伤则血流滞涩则成瘀，或津亏燥热，煎熬血液而瘀滞。本病责之于虚，湿、热、瘀胶着痼结，延绵不愈，久之郁阻肾络，积弊沉疴，治以清利湿热、祛瘀通络，切勿忘本虚以顾护脾胃。

从药物频次统计结果可以看出，治疗湿热血瘀型DKD药物以陈皮、黄连、茯苓、半夏以及黄芪等健脾祛湿药为主，其中半夏有毒，少量合理地辅用，可发挥化湿痰、降浊邪的作用，提高降压减脂之效[17]。黄芪为治疗DKD要药，且用量宜大，旨在脾气健运，水湿得化，以减轻蛋白尿，保护肾组织[18]。临床使用的药物多为苦寒、入肝经的清热祛湿、散瘀通络之品，诸如黄连、大黄、赤芍及丹参等，或性味甘温、入脾经的黄芪、白术等顾护正气之药，祛邪不忘扶正，标本同治，以“调”为用，以达阴平阳秘。

临床辨治DKD遵从“观其脉证，知犯何逆，随证治之”的治则，湿热不祛，蛋白难消，瘀血不除，肾气难复，在清利湿热、祛瘀通络大法的前提下，重视个体化原则。基于系统聚类和因子分析，辨证偏湿热痰浊，明其理而化其意，舌苔见黄腻或白厚，脉象滑数者可用C1组方治疗，即F1、F3、F8、F10合方，寓有黄连温胆汤之意，清热燥湿、理气祛痰，药专力宏，可获良效，但久服易清热过度，应中病即止。辨证偏下焦湿热者，采用C3组方以清利湿热，即F4、F11合方，为四妙散加减而成，方中黄柏苦寒，配伍苦温之苍术，寒温并施，健脾燥湿，标本同治，黄芩清泄中上焦湿热，薏苡仁入足阳明经发挥健脾渗湿、缓急舒筋之效。辨证偏血瘀者，采用C6组方以化瘀消积，即F2、F5、F6合方，邪气深入血分，也可联用C5组方增其祛瘀之效。

3.2 核心药物“黄连-赤芍-陈皮-竹茹”治疗湿热血瘀型DKD的作用机制

本研究利用网络药理学和分子对接技术初步探讨了核心药物“黄连-赤芍-陈皮-竹茹”治疗DKD的作用机制。从核心药物中筛选了可作用于DKD治疗靶点蛋白的有效活性成分，槲皮素(HL9)、苜蓿素(ZR12)、4-羟基-3-甲氧基肉桂醛(ZR2)、二氢川陈皮素(CP4)和黄芩素(CS4)为对应靶点数量较多的有效活性成分。其中HL9可通过改善氧化应激和抗炎的作用机制，对早期DKD起到保护作用[19,20]。黄芩素能够抗高糖诱发的氧化应激，抑制炎症因子表达，缓解DKD病情进展引起的肾小管上皮细胞损伤，从而保护肾脏[21]。同时这几种有效成分均为“黄连-赤芍-陈皮-竹茹”所含，且均具有较好的口服利用度与成药性，说明这4味中药治疗DKD均发挥了重要作用。同时，本研究发现“黄连-赤芍-陈皮-竹茹”联合治疗DKD靶点蛋白PPI网络中评分较高的靶点蛋白也是HL9、ZR12、ZR2、CP4和CS4的作用靶点蛋白，并可以富集到多条与疾病相关的信号通路中。

研究发现，FOS、IFNG、TGF-β1、NFKB1A、MAPK8以及IL-2可能为“黄连-赤芍-陈皮-竹茹”联合治疗DKD的核心靶点蛋白。Fos作为早期介导的主要转录因子，是即早基因c-Fos的表达产物。研究表明，c-Fos参与多种细胞过程的分子机制以及细胞内的信息传递，在肾脏疾病中呈现高表达，影响病程中的炎性因子的释放，调控DKD所致的肾小球系膜细胞增殖，c-Fos上调可加速 TGF-β1 的过度表达，从而引起肾脏纤维化进行性加重[22,23]。IFNG是炎性细胞因子，能直接损伤肾小球内皮细胞以及肾细胞微血管的形成[24]。TGF-β1介导DKD肾小球硬化和肾纤维化病变[25]。NF-κB 可调控糖脂代谢，在高糖高脂微环境下，NF-κB信号通路中的NFKB1基因突变可损害内皮细胞[26]。IL-2是促炎因子，MAPK8基因与脂肪代谢有关，炎症反应和脂质代谢紊乱是DKD发生的重要危险因素[27]。

KEGG通路富集分析显示，核心药物治疗DKD的作用靶点可能作用于AGE-RAGE、H1F以及PI3K-Akt等信号通路发挥调节作用。研究表明，AGE-RAGE信号通路和DKD的发生紧密联系，机体内葡萄糖水平升高，与蛋白质发生反应形成AGEs, 可与多配体跨膜受体RAGE结合形成 AGEs-RAGE,启动下游NF-κB、NADPH和MAPK等通路，诱导DKD足细胞凋亡、炎症反应及氧化应激[28,29]。RAGE与其配体结合可激活PI3K-Akt信号通路，该信号通路的过度激活会引起肾损伤[30,31]。HIF-1信号通路与血管生成、炎症反应及能量代谢等有关[32]。早期DKD患者因微循环障碍引起肾小管间质缺氧，肾组织HIF-1α表达增加，上调多个靶基因减轻肾组织在缺氧环境下的损害，以达到保护肾细胞的目的[33]。

综上所述，本研究基于“真实世界”数据分析了中医药治疗湿热血瘀型DKD用药规律以及核心药物“黄连-赤芍-陈皮-竹茹”配伍治疗DKD关键的潜在药效成分、作用靶蛋白和作用途径，并通过分子对接技术进一步验证结果的合理性和准确性，使本研究结果更具有指导意义。但由于真实世界研究方法尚未成熟，在此基础上，后续将进行RCT试验互相印证，以期更好地指导湿热血瘀型DKD临床用药。

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基金资助:国家重点研究开发计划基金项目(2020YFE0201800);国家中医临床研究基地科研专项课题项目(2021JDZY068);河南省中医药科学研究专项课题项目(2022ZY1007);国家级大学生创新创业训练计划项目(2021104710044,202110471002);河南中医药大学科研苗圃工程项目(MP2022-1,MP2022-88);

文章来源:陈占科,陈凯丽,刘昊霖,等.中医药治疗糖尿病肾脏疾病湿热血瘀证用药规律及作用机制[J].中医学报,2024,39(05):1114-1124.