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miR-221-5p靶向VDR调控肾透明癌上皮细胞-间充质转化的机制

2024-09-24 62 上传者：管理员

摘要：目的探讨微小RNA(miR)-221-5p靶向维生素D受体(VDR)调控肾透明癌上皮细胞-间充质转化的潜在机制。方法过表达或敲低miR-221-5p后，检测肾透明癌细胞786-O中VDR的表达水平。荧光素酶报告实验检测miR-221-5p是否靶向VDR。过表达或敲低miR-221-5p及过表达VDR或敲低VDR后，检测786-O中上皮细胞-间充质转化标志蛋白[E-钙黏蛋白(Cadherin)、β-连环蛋白(Catenin)和紧密连接蛋白(ZO)-1]表达水平、线粒体功能相关蛋白[电压依赖性阴离子通道蛋白(VDAC)1、线粒体内膜中视神经萎缩症蛋白(OPA)1和线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)]的表达水平及线粒体呼吸水平[基础呼吸、三磷酸腺苷(ATP)相关呼吸和最高呼吸]。结果过表达miR-221-5p在肾透明癌细胞中导致VDR的mRNA和蛋白水平明显下降(P<0.05),而敲低miR-221-5p则相反。进一步的双荧光素酶报告表明，miR-211-5p mimic能够针对野生型VDR mRNA-3′UTR组明显降低荧光素酶活性(P<0.05),但在突变型VDR mRNA-3′UTR组无明显差异(P>0.05)。此外，miR-221-5p过表达或VDR的敲低会导致肾透明癌细胞中上皮细胞-间充质转化标志蛋白的水平明显上升，而反之则明显下降(P>0.05),共表达或共敲低miR-221-5p和VDR时以上蛋白水平未发生显著变化(P>0.05)。miR-221-5p过表达或VDR敲低会导致线粒体功能相关蛋白水平明显下降，反之则明显上升(P<0.05),但是共表达或共敲低miR-221-5p和VDR时以上指标未发生显著变化(P>0.05)。miR-221-5p过表达或VDR敲低导致肾透明癌细胞中线粒体呼吸相关参数明显下降，反之则明显上升(P<0.05),但是共表达或共敲低miR-221-5p和VDR时以上指标未发生显著变化(P>0.05)。结论 miR-221-5p通过调控VDR表达水平影响肾透明癌细胞的上皮细胞-间充质转化、线粒体功能及线粒体呼吸。

关键词：
上皮细胞-间充质转化
微小RNA(miR)-221-5p
线粒体
维生素D受体(VDR)
肾透明癌
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肾细胞癌(RCC)源于肾实质或肾小管上皮，是肾癌中最常见的类型之一，占据了90%的病例，其在泌尿系统肿瘤中的发病率排名第三[1]。其中，透明细胞RCC(ccRCC)是RCC中最常见的亚型，约占RCC病例的80%[2]。早期ccRCC患者常缺乏明显的临床症状，导致大约30%的患者在初次诊断时已处于晚期[3]。尽管部分或根治性肾切除术是早期ccRCC患者的主要治疗方法，但仍有30%的患者可能会出现复发或转移[4]。上皮细胞-间充质转化(EMT)是一种促进原发性上皮肿瘤恶性细胞转移的遗传程序[5]。在EMT过程中，细胞通过重组黏附和细胞骨架结构失去上皮表型，从而获得间充质形态和迁移能力[6]。为了更好地了解ccRCC的病理机制和作出临床决策，有必要深入研究其发生和发展机制。微小RNA(miR)-221-5p在结直肠癌和前列腺癌中已被证明具有抑制肿瘤生长的作用，并且能够靶向细胞因子信号传导抑制蛋白(SOC)1促进ccRCC进展[7]。在正常肾组织中，维生素D受体(VDR)水平保持充足且恒定，但在RCC恶性转化中，VDR水平显著下降[8]。研究发现[9],VDR通过调节上调线粒体功能抑制EMT,进而可能影响肾癌的发展。已有研究表明[10],1,25(OH)2D3/VDR途径通过抑制β-连环蛋白(Catenin)/Smad3或DNA损伤修复途径，显著抑制癌症进展和癌基因诱导的衰老，而β-Catenin是EMT的标志蛋白。因此，在ccRCC中，miR-221-5p/VDR是否会影响EMT及这种影响是否与线粒体功能相关，目前尚不清楚。本研究探讨miR-221-5p靶向VDR调控肾透明EMT的机制。

1、材料与方法

1.1 材料

肾透明癌细胞786-O购自普诺赛公司(货号：CL-0010)。Lipofectamine3000购自北京峰格生物技术有限公司(货号：L3000-015)。VDR、E-钙黏蛋白(Cadherin)、β-Catenin、紧密连接蛋白(ZO)-1、电压依赖性阴离子通道蛋白(VDAC)1、线粒体内膜中视神经萎缩症蛋白(OPA)1、线粒体钙离子单向转运蛋白(MCU)和GAPDH抗体购自Abcam(货号：ab109234、ab231303、ab224803、ab307799、ab306581、ab157457、ab272488、ab8245)。Trizol试剂购自北京金优科技有限公司(货号：CW0580)。Prime Script RT试剂盒购自广州慧恒生物科技有限公司(货号：RR047A)。SYBR Green购自北京富百科生物技术有限公司(货号：003)。双荧光素酶试剂盒购自浙江麦飞生物科技有限公司(货号：MH1057-100T)。Seahorse XF细胞线粒体压力检测试剂盒购自北京百瑞奥生物技术有限公司(货号：103015-100)。miR-NC、miR-221-5p mimics、miR-221-5p inhibitor、siNC、siVDR、Vector、VDR过表达质粒均由北京擎科生物科技有限公司提供。

1.2 分组与处理

根据不同处理miR-NC组(转染miRNA阴性对照序列)、miR-221-5p mimics组(过表达miR-221)、miR-221-5p inhibitor组(敲低miR-221)、siNC组(转染siRNA阴性对照序列)、siVDR组(敲低VDR)、Vector组(过表达空载体)、VDR组(过表达VDR)、miR-221-5p mimics + VDR组(共表达miR-221和VDR)、miR-221-5p inhibitor + siVDR组(共敲低miR-221和VDR)。

1.3 细胞培养与处理

786-O在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中进行培养。该培养基中添加10%胎牛血清，并辅以100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素，以确保细胞生长环境的纯净与安全，并置于恒温37 ℃和5% CO2的适宜条件下。使用Lipofectamine3000进行miR-NC、miR-221-5p mimics、miR-221-5p inhibitor、siNC、siVDR、Vector、VDR过表达质粒的转染。

1.4 Western印迹

为从肾透明癌细胞中获取总蛋白，使用了蛋白裂解缓冲液进行提取。随后，通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对细胞裂解物进行了分离。接下来，将分离的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，并用5%的脱脂牛奶进行了封闭处理。然后，用特异性的一抗(包括VDR、E-Cadherin、β-Catenin、ZO-1、VDAC1、OPA1、MCU和GAPDH)对膜进行了培养。经过洗涤后，使用二抗对膜进行了进一步的培养。为确保实验结果的准确性，选用了GAPDH作为内参照，并重复了实验3次。

1.5 实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)

根据操作指南，利用Trizol试剂成功地从肾透明癌细胞中提取了总RNA。随后，利用Prime Script RT试剂盒，将提取的RNA有效地反转录为互补DNA。在后续的实时PCR分析中，选用了SYBR Green作为荧光染料。整个PCR体系包含以下步骤：首先在95 ℃条件下培养3 min, 然后经过35个循环，每个循环包括94 ℃变性15 s, 55 ℃退火25 s及72 ℃延伸15 s。反应体系中各组分比例为：1 μl的cDNA样品，1.0 μl的RT引物，12.5 μl的SYBR Premix Ex TaqⅡ及10.5 μl的双馏水。为确保结果的准确性，选用了GAPDH和U6分别作为VDR和miR-211-5p的内参照基因。

1.6 荧光素酶报告实验

通过在线生物信息学平台(http: //mirdb.org/),成功预测miR-211-5p与VDR之间的潜在结合位点。随后，获得包含这一结合位点的野生型VDR(WT-VDR)及突变型ATP2A2(MUT-VDR)。接着，选取了处于对数生长期的肾透明癌细胞，并遵循Lipofectamine3000转染试剂的使用说明，分别将VDR mRNA的野生型载体、突变型载体与对照模拟物或miR-211-5p模拟物共转染至A549细胞中。经过48 h的培养，利用双荧光素酶试剂盒检测每组肾透明癌细胞的相对荧光素酶活性。

1.7 细胞呼吸水平的测定

为了全面评估肾透明癌细胞的线粒体功能，严格遵循Agilent Technologies的操作指南，采用Seahorse XF细胞线粒体压力检测试剂盒。这一试剂盒中配备了关键的调节剂，包括1.5 μmol/L的寡霉素、0.5 μmol/L的羰基氰-4(三氟甲氧基)苯基腙及0.5 μmol/L的鱼藤酮/抗霉素A。为确保结果的准确性和可靠性，为每组设置了5个重复样本，从而能够更精确地反映肾透明癌细胞线粒体的功能状态。

1.8 统计学分析

采用SPSS17.0软件进行方差分析、Student-t检验。

2、结果

2.1 miR-221-5p靶向VDR

过表达miR-221-5p后，肾透明癌细胞中VDR mRNA和蛋白表达(0.04±0.01、0.13±0.03)均较miR-NC组(0.26±0.05、1.00±0.06)明显下降(P<0.05);而敲低miR-221-5p后，肾透明癌细胞中VDR mRNA和蛋白表达(0.73±0.07、2.49±0.71)均较miR-NC组明显上升(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示，在转染野生型的VDR mRNA-3′UTR组，miR-211-5p mimic可明显降低肾透明癌细胞荧光素酶活性(98.91±4.22 vs 11.68±2.38,P<0.05);而在转染突变型的VDR mRNA-3′UTR组，肾透明癌细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(98.91±4.22 vs 98.52±7.11,P>0.05)。

2.2 miR-221-5p/VDR轴对调控肾透明癌EMT的影响

过表达miR-221-5p或敲低VDR后，肾透明癌细胞中EMT标志蛋白E-Cadherin、β-Catenin和ZO-1的蛋白表达显著上升(P<0.05);而敲低miR-221-5p或过表达VDR后，肾透明癌细胞中E-Cadherin、β-Catenin和ZO-1蛋白表达显著下降(P<0.05);但是共表达或共敲低miR-221-5p和VDR,肾透明癌细胞中EMT标志蛋白表达无显著变化(P>0.05),见表1。

2.3 miR-221-5p/VDR轴对线粒体功能的影响

过表达miR-221-5p或敲低VDR后，肾透明癌细胞中线粒体基础呼吸、三磷酸腺苷(ATP)相关呼吸和最高呼吸水平显著下降(P<0.05);而敲低miR-221-5p或过表达VDR后，肾透明癌细胞中线粒体基础呼吸、ATP相关呼吸和最高呼吸水平显著上升(P<0.05);但是共表达或共敲低miR-221-5p和VDR,肾透明癌细胞中线粒体基础呼吸、ATP相关呼吸和最高呼吸水平无显著变化(P>0.05),见表1。过表达miR-221-5p或敲低VDR后，肾透明癌细胞中线粒体功能相关蛋白VDAC1、OPA1和MCU蛋白表达水平显著下降(P<0.05);而敲低miR-221-5p或过表达VDR后，肾透明癌细胞中线粒体功能相关蛋白VDAC1、OPA1和MCU蛋白表达水平显著上升(P<0.05);但是共表达或共敲低miR-221-5p和VDR,肾透明癌细胞中线粒体功能相关蛋白表达水平无显著变化(P>0.05),见表2。

与miR-NC组相比：1)P<0.05;表2同

表1 miR-221-5p靶向VDR调控EMT标志蛋白相对表达水平及线粒体呼吸水平比较

表2 miR-221-5p靶向VDR调控线粒体功能相关蛋白相对表达水平比较

3、讨论

RCC是一种常见的恶性肿瘤类型，在泌尿系统肿瘤中排名第三[11～14]。虽然部分或根治性肾切除是早期ccRCC的主要治疗手段，但仍有30%的患者可能会出现复发或转移的情况。为了更好地理解ccRCC的发病机制和指导临床决策，对其发生和发展机制的研究至关重要。

miRNA是一类保守的内源性非编码RNA,其通过与靶向mRNA的结合来调节基因表达[15]。miR-221-5p在其他癌症中已被证明具有抑制肿瘤生长的作用，并且被发现可以靶向SOC1促进ccRCC的进展[7]。本研究发现，miR-221-5p能够靶向VDR,miR-221-5p能够影响ccRCC中VDR的表达水平，并且这一途径可能参与了EMT的调控，进一步影响肾癌的发展进程。VDR是类固醇受体家族的成员，对骨骼健康和钙磷稳态至关重要。VDR形成VDR-视黄酸X受体异二聚体复合物，并在被1,25(OH)2D3激活后结合到特定的DNA序列上[16]。在正常肾组织中，VDR水平保持充足且稳定，但在RCC的恶性转化过程中，VDR水平显著下降[8]。因此，miR-221-5p通过VDR调控ccRCC的EMT水平。

本研究还发现，miR-221-5p/VDR途径与线粒体功能有关。miR-221-5p过表达或VDR敲低会导致肾透明癌细胞中EMT标志蛋白及线粒体功能相关蛋白水平改变。VDR在线粒体呼吸过程中发挥着重要作用。据报道[17],VDR在线粒体呼吸链活动中具有重要的生物合成功能，并在细胞增殖过程中促进产生能量的三羧酸循环。有研究表明[18],在人类表皮角质细胞系中，VDR消减会增加活性氧的产生，导致细胞损伤、线粒体完整性丧失，甚至凋亡。相反，维生素D处理可抑制肌细胞中的氧化应激和线粒体动力学[19]。研究发现[10],VDR通过调节上皮线粒体功能抑制EMT。表明miR-221-5p/VDR/线粒体途径可能在肾癌的发展中发挥着重要的调控作用。

综上，miR-221-5p通过调控VDR表达水平影响肾透明癌细胞的EMT、线粒体功能及线粒体呼吸。

基金资助:河南省医学科技攻关计划(联合共建)项目(LHGJ20190433);

文章来源:张群妹,狄文玉,王海峰,等.miR-221-5p靶向VDR调控肾透明癌上皮细胞-间充质转化的机制[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4283-4286.