宫颈癌是全球第四大最常见的癌症和妇科癌症相关死亡的原因。据相关报道统计，在2020年全球约有60万名妇女被诊断患有宫颈癌，约34万人死于宫颈癌[1]。虽然宫颈癌通过化疗、放疗和手术切除等治疗改善了早期宫颈癌患者的预后，但是晚期患者的放疗敏感性低下和存在化疗耐药性，常常导致复发、转移甚至死亡，这严重影响了宫颈癌治疗的效果，限制了同步放化疗的临床应用[2]。因此，需要深入了解宫颈癌发展的机制，并寻找新的治疗分子靶点来改善宫颈癌患者的治疗效果。核基质结合区结合蛋白1 (SATB1)基因位于3号染色体3短臂23区上，介导染色质重塑，进行基因调控[2]。有研究报道，SATB1在多种肿瘤中过度表达，并发挥促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等重要作用[3,4,5]。ZHAO等[6]研究发现，SATB1在宫颈癌组织中呈高表达，且SATB1高表达患者与国际发立科联合会(FIGO)分期、组织学分级和不良预后相关。SATB1作为p21活化激酶5(PAK5)和微小RNA-100(miR-100)的下游调控基因参与调控宫颈癌细胞的侵袭和转移能力[7]。同时，SATB1在肿瘤治疗抵抗中也发挥着促进作用，直肠癌放疗患者中报道SATB1阳性与患者术前放疗反应降低、早期转移和生存率降低呈独立相关性[8]。但SATB1是否与宫颈癌患者放疗敏感性相关尚不清楚，本文对SATB1在宫颈癌增殖、转移和放疗抵抗中发挥的作用进行研究，旨在探讨SATB1作为宫颈癌治疗的潜在分子靶点的依据。

1、资料与方法

1.1 一般资料

收集入住北京大学肿瘤医院内蒙古医院/内蒙古医科大学附属肿瘤医院(下称本院)并行子宫手术切除的62例宫颈癌患者的成对的癌组织和相邻的非肿瘤组织。纳入标准：(1)首次确诊为宫颈癌，并经病理证实；(2)手术前未接受过任何形式的抗肿瘤治疗；(3)原发性宫颈癌，未发生转移，并且未合并其他类型的恶性肿瘤；(4)手术时间为2014年8月至2017年10月，并且具有完整的随访资料；(5)签署患者知情同意书。本研究所有标本操作均由本院伦理委员会审核通过。

1.2 主要试剂

无水乙醇、甲醛及二甲苯(广东中海南联能源有限公司);DAKO免疫组化检测试剂盒(丹麦);枸橼酸钠抗原修复液和PARP蛋白裂解液(北京索莱宝试剂公司);宫颈癌肠转移细胞(CaSki)(美国ATCC细胞库);细胞培养基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(美国Gibco试剂公司);SATB1 siRNA(广州锐博生物生物技术有限公司);蛋白高效裂解液(北京Solarbio试剂有限公司);蛋白上样缓冲液和BCA蛋白浓度检测试剂盒(上海碧云天试剂有限公司);PVDF膜(美国Promega公司);ECL化学发光试剂盒(翌圣生物科技上海有限公司);CCK8检测试剂(英国Abcam公司);Transwell小室(美国Coring公司);SATB1一抗和鼠二抗、兔二抗(美国Proteintech公司)。

1.3 免疫组化

所有癌组织和相邻的非肿瘤组织样本均用福尔马林固定24 h。用标准技术将其包埋为石蜡蜡块，并经切片机制成4 μm厚的切片。根据免疫组化检测试剂盒的说明书进行免疫组织化学染色。用小鼠IgG代替一抗作为阴性对照。然后，使用显微镜观察切片。在高倍镜下，在每个切片的5个随机选择的视野中测定染色阳性细胞的数量和强度。阳性细胞百分比评分如下：1分为<5%;2分为5%～25%;3分为>25%～50%;4分为>50%～75%; 5分为>75%。强度评分如下：0分为无染色；1分为弱染色；2分为中度染色；3分为强染色。使用以下公式计算总得分：总得分=百分比得分×强度得分。<2分被定义为阴性，≥2分被定义为阳性。

1.4 细胞培养和转染

CaSki细胞复苏后，800 r/min离心去除冻存液，放置在含有10%FBS的PRMI 1640培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，在倒置显微镜下观察细胞生长。每2天更换一次培养基，待细胞生长至约80%,用胰蛋白酶消化传代。取生长良好的细胞进行后续的实验研究。

1.5 细胞转染

取生长良好的细胞，在第1天晚上接种至6孔板中，每孔的细胞密度为70%～80%,并确保细胞均匀分布在6孔板的底部。待细胞贴壁后，随机分为si-NC组和si-SATB1组，并于当天上午进行质粒转染；si-NC组转染2.5 μg NC siRNA和10 μL Lipo3000;si-SATB1组转染2.5 μg SATB1 siRNA和10 μL Lipo3000。NC siRNA序列为5′-AAG TCT TCT GAC GCT GCT GCC TGG TCC AG-3′,SATB1 siRNA序列为5′-AGA TTC AGC AGG AAA TGA AGC GTG CTA AA-3′ 。转染48 h后进行采用Western blotting检测转染效果。

1.6 CCK8实验

细胞增殖能力检测：转染48 h后，各组细胞经胰蛋白酶处理，制备成单细胞悬浮液，进行细胞计数，并采用无血清培养基调整细胞浓度至2×103个/毫升，均匀地铺至96孔板中，在细胞贴壁后计为0点，每隔24 h计为1个时间点，时间点分别计为0、24、48、72和96 h, 每个时间点设置6个复孔，放置在37 ℃和5% CO2饱和湿度下培养。在相对应的时间点加入20 μL CCK8试剂，继续孵育2 h。采用酶标仪检测450 nm处各孔细胞的吸光度(A)值。

细胞放疗敏感性检测：转染48 h后，各组细胞经胰蛋白酶处理，制备成单细胞悬浮液。进行细胞计数，并采用无血清培养基调整细胞浓度至2×103个/毫升，均匀地铺至96孔板中，在细胞贴壁后，随机分为0、2、4、6和8 Gy, 每组设置6个复孔，进行相应放射剂量的照射，放置在37 ℃和5% CO2饱和湿度下培养48 h, 并每孔细胞加入20 μL CCK8试剂，继续孵育2 h。采用酶标仪检测450 nm处各孔细胞的A值，计算细胞存活率=对应放射剂量细胞A值/0 Gy细胞A值。

1.7 Transwell实验

转染48 h后，各组细胞经胰蛋白酶处理，制备成单细胞悬浮液。用无血清培养基洗涤细胞2次后，进行细胞计数，并采用无血清培养基调整细胞浓度至1×105个/毫升。取100 μL细胞悬浮液缓慢滴入Transwell小室的上室中的聚碳酸酯膜上。取500 μL含有10%胎牛血清的完整培养基加入下室腔中，并在37 ℃和5% CO2饱和湿度下培养12 h。用棉签轻轻擦拭并清洗上室膜上未穿透膜的细胞。用甲醇固定细胞15 min, 苏木精染色10 min, 干燥后，用刀片轻轻切割聚碳酸酯膜至载玻片上，并用中性树胶固定。在显微镜下观察穿过膜的细胞数量。随机选择5个高倍视野，并拍摄和记录。

1.8 Western blotting检测蛋白表达

转染48 h后，丢弃细胞培养基。用PBS洗涤3次后，加入制备的RIPA细胞裂解缓冲液(1×RIPA∶100×CK∶100×磷酸酶抑制剂=100∶1∶1)以充分裂解。将裂解物吸入标记的EP管中，放置于超声机中裂解30 min。12 000×g离心30 min, 将上清液转移到新的EP管中。用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白质样品与5×SDS加载缓冲液的以体积比4∶1混合，在95 ℃水浴中煮沸10 min。配置10%聚丙烯酰胺凝胶，加样后进行凝胶电泳，湿转移120 min至PVDF膜上。5%脱脂奶粉孵育PVDF膜60 min, 并加入一抗稀释液在4 ℃下孵育过夜。采用TBST洗涤10 min×3次，加入按适当比例稀释的二抗，室温孵育60 min, 采用TBST洗涤10 min×3次，采用ECL发光试剂盒暴露并计算目的蛋白的表达水平。

1.9 统计学处理

采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，所有计量数据均表示为x¯±s

,采用t检验对两组之间的均值进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 免疫组化检测

SATB1在宫颈癌组织中的表达水平 免疫组化检测结果显示，SATB1在宫颈癌组织和相邻的非肿瘤组织中的阳性表达率分别为53.23%(33/62)和32.26%(20/62)。与非肿瘤组织中SATB1的表达相比，宫颈癌组织中SATB1的阳性表达率显著升高(χ2=5.569,P=0.018),见图1。

图1 免疫组化检测SATB1在宫颈癌组织中的表达 水平(×100)

2.2 SATB1表达水平与宫颈癌患者临床病理参数的关系

χ2检验分析显示，SATB1的表达水平与宫颈癌患者的年龄、组织学类型、分化程度和肌层浸润深度均无相关性(P>0.05),与宫颈癌肿瘤最大径、FIGO分期和淋巴结转移显著相关，SATB1在肿瘤最大径较大、FIGO分期晚期及淋巴结转移的宫颈癌组织中SATB1的阳性表达率升高(P<0.05)。见表1。

表1 SATB1的表达水平与患者临床病理参数的 关系[n(%)]

2.3 SATB1表达水平对宫颈癌患者预后的影响

采用Kaplan-Meier绘制生存曲线，Log-Rank分析SATB1表达水平对宫颈癌患者生存预后的影响。与低表达SATB1的宫颈癌患者相比，高表达SATB1的宫颈癌患者预后较差(χ2=5.73,P=0.017),见图2。

图2 Log-Rank分析SATB1对宫颈癌患者预后   

2.4 Western blotting检测SATB1 siRNA转染宫颈癌细胞CaSki的效果

采用Western blotting检测SATB1 siRNA转染宫颈癌细胞CaSki的效果，结果显示si-NC组和si-SATB1组SATB1蛋白表达量分别为(0.73±0.14)和(0.25±0.04),与si-NC组相比，si-SATB1组细胞中SATB1蛋白表达量显著降低，差异有统计学意义(t=5.710,P=0.002),见图3。

图3 Western blotting检测SATB1 siRNA转染宫颈癌 细胞效果   

2.5 CCK8实验检测SATB1 siRNA对宫颈癌细胞CaSki增殖能力的影响

CCK8实验结果显示与si-NC组细胞相比，si-SATB1组CaSki细胞增殖能力降低，差异有统计学意义(P<0.05),见图4和表2。

图4 CCK8实验检测SATB1 siRNA对宫颈癌细胞Ca Sik增殖能力的影响   

表2 不同时间点各组CaSki细胞的A值(x¯±s)

2.6 Transwell实验检测SATB1 siRNA对宫颈癌细胞CaSki转移能力的影响

Transwell实验结果显示，si-NC组和si-SATB1组穿膜细胞数目为(86.67±12.95)个和(52.33±9.04)个，与si-NC组细胞相比，si-SATB1组CaSki细胞转移能力显著降低，差异有统计学意义(t=3.766,P=0.013),见图5。

图5 Transwell实验检测SATB1 siRNA对宫颈癌 细胞Ca Sik转移能力的影响(×100)  

2.7 CCK8实验检测SATB1 siRNA对宫颈癌细胞CaSki放疗敏感性的影响

CCK8实验结果显示，与si-NC组相比，si-SATB1组CaSki细胞的细胞存活率降低，放疗敏感性升高，差异有统计学意义(P<0.05),见图6和表3。

2.8 SATB1 siRNA对CaSki细胞Wnt/β-catenin信号通路及其下游基因表达的影响

Western blotting实验结果显示，与si-NC组细胞相比，si-SATB1组CaSki细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin及其下游蛋白cyclinD1、cMYC和MMP-2表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.05),见图7和表4。

图6 CCK8实验检测SATB1 siRNA对宫颈癌细胞Ca Sik放疗敏感性的影响   

表3 不同放射剂量处理各组CaSki细胞的细胞 存活率(x¯±s)

图7 Western blotting实验检测SATB1对CaSki细胞 细胞周期蛋白和转移蛋白表达的影响  

表4 干扰SATB1的表达对Wnt/β-catenin信号通路关键 蛋白及其下游基因表达的影响(x¯

3、讨 论

宫颈癌的发病多归因于人类乳头瘤病毒(HPV)感染，尽管有效的早期筛查和HPV疫苗接种大大降低了世界范围内的宫颈癌发病率和病死率，但宫颈癌的临床症状和体征在早期仍然隐匿，不易被发现，确诊时往往已处于晚期，导致患者临床治疗效果较差及生存预后不佳，特别是在低收入国家[1]。因此，识别新的治疗靶点对于提供用于宫颈癌治疗的有价值的策略具有重要的研究意义。有研究显示，转录调控蛋白在调控基因转录过程中不仅影响染色体基因表达的数目，还可以对染色体基因表达造成影响，其表达水平异常可导致细胞生长发育异常，引起肿瘤的发生发展。SATB1属于转录调控蛋白的一员，SATB1通过与核基质结合，诱导形成3D染色质环，以及通过调控表观遗传组学包括甲基化和乙酰化调控1 000多个基因表达[2]。同时，SATB1是一种T细胞特异性因子，参与胸腺细胞的发育。研究显示，SATB1在肿瘤中的表达水平异常，并在肿瘤的恶性进展中发挥关键作用[9]。

有研究报道，SATB1在前列腺癌、胃癌和非小细胞肺癌等实体瘤[3,4,5]、急性髓系白血病和皮肤T细胞淋巴瘤等[10,11]血液系统肿瘤中均发挥促癌作用。在前列腺癌组织中SATB1表达水平增加，SATB1表达水平与患者术前前列腺特异抗原水平、术后Gleason评分、TNM分期和淋巴结转移相关[3]。在胃癌中，SATB1敲低通过抑制HER3的表达水平，消除HRG对MET的抑制作用，增加胃癌细胞化疗的敏感性[4]。SATB1作为非小细胞肺癌中上皮-间质转化过程中的调节因子。这均表明SATB1在恶性肿瘤中发挥关键作用[5],但是SATB1在宫颈癌中发挥的具体作用尚未见明确报道。ZHAO等[6]对33例宫颈癌组织检测结果显示，SATB1在宫颈癌组织中表达水平升高，且SATB1高表达组患者FIGO分期、组织学分级及预后均显示不良，SATB1在宫颈腺癌中的表达水平显著高于在宫颈鳞状细胞癌中的表达水平。本文检测了62对宫颈癌组织和非癌组织中SATB1的表达水平情况，同样得出SATB1在宫颈癌组织中呈高表达，并与宫颈癌肿瘤最大径、FIGO分期和淋巴结转移显著相关，但是并没有显示SATB1表达水平与宫颈癌组织类型相关，宫颈癌有两种主要类型：宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌，其中宫颈鳞状细胞癌占80%～85%[12],ZHAO等[6]研究中包含的宫颈腺癌例数为8例，本文中宫颈腺癌的例数为10例，分析原因可能是样本量较小，后续会扩大样本量进一步研究。

在组织水平的研究已提示SATB1发挥促癌作用的情况下，HUO等[7]报道PAK5通过介导SATB1的Ser47位点磷酸化启动上皮间质转化过程级联反应，促进宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。同时SATB1在胃癌和鼻咽癌中促进肿瘤细胞的增殖和转移能力[4,13],提示SATB1可能促进宫颈癌细胞的增殖和转移能力，本文在宫颈癌细胞中干扰SATB1的表达水平后发现宫颈癌细胞的增殖和转移能力降低，表明SATB1促进宫颈癌细胞增殖和转移。有研究报道，在直肠癌中降低SATB1的表达并增强直肠癌细胞敏感性，SATB1可预测直肠癌术前放疗的反应和临床结果[8]。本文在放射处理宫颈癌细胞并干扰SATB1的表达水平后，发现干扰SATB1的表达水平会增强宫颈癌细胞的放疗敏感性。RAO等[14]报道SATB1靶向β-catenin促进滋养细胞的侵袭和迁移能力，以及在肺癌细胞中miR-448靶向SATB1抑制Wnt/β-catenin途径抵抗肿瘤细胞顺铂耐药性[15],均提示SATB1与Wnt/β-catenin信号通路的调控密切相关。Wnt/β-catenin是促进肿瘤增殖、转移、化疗耐药及放疗抵抗等恶性生物学行为的重要信号通路，在宫颈癌中也处于激活状态[16]。经典的Wnt/β-catenin信号通路的活化需要β-catenin累积入细胞核，激活下游的靶基因，包括增殖、侵袭转移、凋亡、耐药、放疗抵抗及干性等基因，其中cyclinD1、cMYC为增殖相关基因，MMP-2为侵袭转移相关基因[17],而本研究发现干扰SATB1的表达后宫颈癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin及其下游蛋白cyclinD1、cMYC和MMP2表达均降低，与RAO等[14]和NING等[15]报道的一致，均显示SATB1通过靶向β-catenin激活Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，不同的是在发挥的作用不同，而本研究提示SATB1可能通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制宫颈癌细胞增殖、转移能力和增强放疗敏感性。但是SATB1在宫颈癌发挥生物学功能的作用机制仍需后续深入探讨。

综上所述，SATB1在宫颈癌中高表达，可能是患者预后不良的分子标志物，同时SATB1可能通过上调Wnt/β-catenin信号通路促进宫颈癌细胞增殖和转移能力，并促进宫颈癌细胞放疗抵抗。SATB1具有作为治疗宫颈癌分子靶点的潜力。

参考文献:

[3]韦付坤,阚懿,刘继海,等.特异性核基质结合区结合蛋白1与转录因子E盒结合锌指蛋白1在前列腺癌组织的表达及其临床意义[J].中华实验外科杂志,2021,38(6):1067-1070.

[12]庞喜侠,刘晓霞.宫颈癌组织基因表达谱差异筛选及功能预测[J].临床医学研究与实践,2022,7(34):13-17.

[16]王玲,王志莲.DKK3､Wnt/β-连环蛋白信号通路与宫颈癌关系的研究进展[J].国际妇产科学杂志,2021,48(5):539-542.

基金资助:内蒙古自治区科技计划项目(202002135);

文章来源:乔娟,杨昊,牛丽红等.干扰SATB1抑制宫颈癌增殖和转移能力及增强宫颈癌放射敏感性的作用研究[J].国际检验医学杂志,2023,44(21):2581-2586.