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抑制miR-34a减轻慢性阻塞性肺疾病急性加重期炎性反应

2024-12-03 37 上传者：管理员

摘要：目的观察慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者肺泡灌洗液中miR-34a及其炎性相关因子的表达水平及其相关机制。方法分别纳入COPD急性加重期患者20例为研究对象组，同期COPD稳定期患者20例为对照组，采集肺泡灌洗液，同时培养鉴定A549细胞，构建AECOPD模型，分别对细胞进行过表达、抑制miR-34a及沉默HIF-1α,采集上清液及肺泡上皮细胞。ELISA法检测肺泡灌洗液及细胞上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平，RT-qPCR检测miR-34a和HIF-1α表达，Western blot检测HIF-1α表达。结果相比于对照组，AECOPD组炎性因子、miR-34a及HIF-1α表达水平明显升高(P<0.05),过表达miR-34a可致HIF-1α和炎性因子表达水平进一步升高(P<0.05),阻断miR-34a可使HIF-1α和炎性因子表达水平明显下降(P<0.05)。AECOPD组HIF-1α表达明显升高(P<0.05),沉默HIF-1α可明显降低炎性因子表达水平(P<0.05),而miR-34a表达水平无明显变化。结论 miR-34a在COPD急性加重期患者中通过调控HIF-1α参与炎性反应损伤，干扰miR-34a/HIF-1α通路可减轻炎性反应程度，为COPD急性加重的靶向干预提供了新的可能性。

关键词：
miR-34a
慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)
炎性反应
缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)
肺功能
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近年来慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)患病率和死亡率呈逐年上升趋势，是全球共同关注的健康问题。COPD急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)患者肺功能明显下降，诊治不及时可发展至呼吸衰竭，死亡风险明显增加。AECOPD的发病机制极其复杂，国内外进行了大量研究仍阐述不清，目前广泛认为炎性反应是其发病基础及推动疾病进展的关键。因此，减轻炎性反应是治疗AECOPD的根本方法，深入研究细胞炎性反应的分子机制能积极有效防治疾病进展。

miRNA与哮喘、肺动脉高压、急性肺损伤、肺纤维化等肺部多种疾病的发病机制相关[1-2],其中也发现了与COPD有关的miRNA[3-4]。miRNAs在COPD发病机制中的研究越来越受重视，但其具体分子机制并未得到证实。miR-34a是一个多功能的miRNA,在COPD患者肺组织中高表达，其上升程度与肺功能受损程度一致，可能在COPD发病机制中发挥重要作用。研究报道miR-34a参与并调节细胞炎性反应，在炎性疾病发病中起关键作用[5]。因此，推测miR-34a可能在AECOPD细胞炎性反应中发挥着重要的作用。本研究通过采集AECOPD患者肺泡灌洗液，建立AECOPD细胞模型，在细胞水平采用过表达和干扰技术，明确miR-34a在AECOPD细胞炎性反应中所起的重要作用，并对其机制进行进一步的深入研究。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象分组及纳入排除标准：

分别选取20例AECOPD患者(Ⅲ级、Ⅳ级)及COPD稳定期(chronic obstructive pulmonary disease in stable period, SCOPD)患者为实验组及对照组，均为南通大学杏林学院附属惠山医院，无锡市惠山区人民医院住院或门诊患者，该实验方案得到了南通大学杏林学院附属惠山医院，无锡市惠山区人民医院呼吸内科伦理委员会批准(编号：HYLL20200715002)。纳入标准：选取纳入患者参照《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》诊断标准。排除标准：1)近期免疫制剂治疗或患有严重免疫系统疾病者；2)合并如气胸、间质性肺病等严重限制性通气功能障碍疾病者；3)支气管镜检查禁忌症患者，如合并严重肾、肝、心脑血管、造血系统及精神疾病不能配合支气管镜检查患者；4)患有严重肺部疾病者，如过敏性肺炎、肺结核、肺癌等；5)合并恶性肿瘤者。AECOPD组根据肺功能指标确定并选取Ⅲ级(重度)及Ⅳ级(极重度)患者。

1.1.2细胞及试剂：

A549肺癌细胞系，无血清F12 K培养基，miR-34a mimic和miR-34a inhibitor(AB公司);Trizol试剂盒(Invitrogen公司);携带特异miR-34a、HIF-1α-siRNA的质粒(武汉华联科生物技术有限公司);4%多聚甲醛(中科迈晨科技有限公司),TaqMan MicroRNA Assay试剂盒(ABI公司)。

1.2方法

1.2.1收集支气管肺泡灌洗液：

所有患者均签署知情同意书，按照《支气管肺泡灌洗细胞学检测技术规范》进行规范支气管镜操作并收集肺泡灌洗液标本(约20～30 mL),离心后收集脱落肺泡上皮细胞，将收集到的肺泡上皮细胞分装冻存待检。

1.2.2 A549细胞的培养、鉴定及AECOPD模型构建：

培养A549细胞，按比例1∶3传代，对数增殖期细胞收集进行实验，完全培养基调整细胞悬液浓度，每孔2 mL装入6孔板中，每孔5×105个细胞，培养箱中培养24 h(5% CO2、37℃)。对照组及AECOPD组换为无血清F12 K培养基，然后依次加入5%的香烟提取物(cigarette smoke extract, CSE)和75 pg/mL的脂多糖(LPS),置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h,构建AECOPD细胞模型，收集细胞进行后续检测。

1.2.3转染AECOPD细胞：

质粒已通过酶切及测序验证正确，将对数增殖期的A549细胞按相同细胞数接种于96孔培养板中，准备细胞使转染细胞汇合度为70%,在37℃,5% CO2孵箱中培养24 h后，使用Lipofectamine® RNAiMAX,将miR-34a mimic、miR-34a inhibitor与HIF-1α-siRNA按照分组分别转染A549细胞，实验重复3次，用Western blot、RT-qPCR及荧光染色法检测分析转染效率，取出细胞进行后续检测，操作严格按照说明书流程进行。

miR-34a mimic、miR-34a inhibitor、HIF-1α-siRNA各自基因序列如下(表1)。

表1 miR-34a mimic、miR-34a inhibitor和HIF-1α-siRNA序列

1.2.4 ELISA法检测炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β水平：

检测各组肺泡灌洗液及上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β水平，按ELISA试剂盒说明书操作。

1.2.5 RT-qPCR法检测miR-34a表达：

检测各组肺泡上皮细胞的miR-34a表达。按照TRizol试剂盒说明书，提取各组肺泡上皮细胞总RNA,测定总RNA浓度和纯度，然后按照TaqManR MicroRNA RT kit和普通反转录试剂盒的要求分别进行miRNA和mRNA的反转录并获得相应的cDNA,以合成的cDNA为模板。严格按照TaqMan MicroRNA Assay试剂盒说明扩增miR-34a,以管家基因β-actin作为内参，ABI 7500荧光定量PCR仪上扩增后目的基因按照2-△△Ct法进行相对定量，每组样品重复试验3次，取平均值进行分析，引物由上海生工公司Primer Premier 5.0软件设计、合成(引物序列如表2)。

表2引物序列

1.2.6 RT-qPCR及Western blot检测HIF-1α表达：

加入RIPA强裂解液匀浆裂解细胞，离心取上清液，BCA法蛋白质定量后以每孔10～20μg总蛋白上样，跑胶分离转膜，室温孵育，TBST洗膜后加入适当浓度比例的HIF-1α一抗4℃孵育12 h以上，TBST进行洗膜，继续二抗37℃孵育2 h, ECL法显色，用凝胶成像仪照相保存，Image J软件分析吸光度值。

1.3统计学分析

数据用均值±标准差表示，应用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，采用单因素方差分析进行多组间比较，采用t检验或LSD检验进行两两比较。

2、结果

2.1 AECOPD肺泡灌洗液中炎性因子水平

与SCOPD患者相比，AECOPD患者肺泡灌洗液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β水平均明显增加(P<0.05)(表3)。

2.2肺泡灌洗脱落肺泡上皮细胞miR-34a表达

AECOPD患者肺泡灌洗脱落肺泡上皮细胞miR-34a表达为17.47±2.78,明显高于SCOPD患者的1.93±0.55(P<0.05)。

2.3肺泡灌洗脱落肺泡上皮细胞HIF-1α蛋白及mRNA表达

AECOPD患者肺泡灌洗脱落肺泡上皮细胞HIF-1α表达明显高于SCOPD患者，其中蛋白质及mRNA表达水平趋势一致(P<0.05)(图1)。

2.4 miR-34a mimic、miR-34a inhibitor、HIF-1α-siRNA在细胞中的转染效率评价

相比于对照组，miR-34a mimic转染细胞后，miR-34a的基因表达量显著升高(P<0.001);与NC组比较，miR-34a inhibitor转染细胞后miR-34a的基因表达量显著下降；与对照组相比，HIF-1α-siRNA转染细胞后HIF-1α蛋白表达量显著下降(图2A～C)。

2.5干扰miR-34a对培养AECOPD细胞上清液中炎性因子水平的影响

与对照组相比，AECOPD培养细胞上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平均明显增加(P<0.05),过表达miR-34a后炎性因子水平较对照组及AECOPD组进一步升高，而阻断miR-34a后炎性因子水平较AECOPD组明显下降(表4)。

2.6干扰miR-34a对培养AECOPD肺泡上皮细胞HIF-1α表达的影响

与对照组相比，AECOPD培养细胞上清液中HIF-1α及miR-34a的表达均明显增加(均P<0.05),过表达miR-34a后HIF-1α表达较对照组及AECOPD组进一步升高，而阻断miR-34a后HIF-1α表达较AECOPD组明显下降(图3)。

2.7沉默HIF-1α 对培养AECOPD细胞上清液中炎性因子水平的影响

与对照组相比，AECOPD细胞上清液中炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平均明显增加(P<0.05)。沉默HIF-1α后炎性因子水平较AECOPD组明显下降(表5)。

2.8沉默HIF-1α 对培养AECOPD肺泡上皮细胞中miR-34a表达的影响

与对照组相比，培养AECOPD肺泡上皮细胞中HIF-1α及miR-34a的表达均增高(P<0.05),沉默HIF-1α后miR-34a表达较对照组及AECOPD组无明显变化(图4)。

表3肺泡灌洗液中IL-8、IL-6、TGF-β和TNF-α的水平

图1灌洗脱落肺泡上皮细胞HIF-1α蛋白及mRNA表达

图2 miR-34a mimic、miR-34a inhibitor、HIF-1α-siRNA在细胞中的转染效率评价

表4细胞培养上清液中IL-8、IL-6、TGF-β和TNF-α的水平

3、讨论

AECOPD患者炎性反应增强，炎性细胞在肺组织及气道浸润，激活释放多种炎性介质致肺组织反复破坏，加剧气道重塑及肺功能降低，死亡风险增加[6]。IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β是AECOPD促炎反应的关键因子，其水平可作为评价AECOPD严重程度的指标。本研究显示AECOPD组患者肺泡灌洗液及细胞上清液中炎性因子IL-8、IL-6、TGF-β、TNF-α水平显著升高，说明AECOPD炎性反应明显增强。

图3肺泡上皮细胞HIF-1α表达

表5细胞培养上清液中IL-8、IL-6、TGF-β和TNF-α的水平

miRNAs在COPD发病机制中的作用越来越受到重视，可能涉及炎性反应、细胞增殖凋亡、肺血管重塑等[7-8]。miR-34a近年来备受关注，其参与了肿瘤、炎性疾病、代谢性疾病等的发生发展[9-11]。有研究发现COPD患者肺组织中miR-34a表达增加，且上升程度与肺功能受损程度一致。本研究也显示AECOPD组肺泡上皮细胞中miR-34a表达明显升高。

炎性反应是众多疾病发病的核心机制，尤其在AECOPD患者中。相关报道认为miR-34a参与并调节机体细胞炎性反应[12]。miR-34a介导FOXP3表达致炎性因子水平升高在哮喘发作中起重要作用，miR-34a调控Klf4和巨噬细胞极化调控LPS诱导的肺损伤和炎性反应[13],miR-34a参与HIV-1 tat介导的小胶质细胞炎性反应。本研究发现给予miR-34a诱导剂后，肺泡上皮细胞炎性损伤进一步加重，给予抑制剂后，炎性损伤明显减轻，说明miR-34a致细胞炎性损伤是AECOPD的重要发病机制。

图4肺泡上皮细胞中miR-34a表达

HIF-1α是炎性反应中关键调节因子，在COPD患者中表达增加，致炎性因子上调，与疾病严重程度有关[14-15]。HIF-1α的表达受miRNA的调控，miR-34a调控HIF-1α参与糖尿病大鼠心脏血管生成[16],miR-34a调节HIF-1α影响肝细胞再生。本研究显示AECOPD患者HIF-1α表达升高，干扰HIF-1α表达后炎性因子水平下降，给予miR-34a诱导剂后，HIF-1α表达升高，炎性损伤进一步加重，给予miR-34a抑制剂后，HIF-1α表达下降，炎性损伤明显减轻，而干扰HIF-1α后miR-34a表达无变化，均提示HIF-1α可能是miR-34a的下游靶基因。

综上所述，miR-34a通过诱导HIF-1α促进炎性介质表达是AECOPD炎性反应损伤的关键因素，干扰miR-34a/HIF-1α通路可减轻AECOPD炎性损伤，为靶向干预和防治AECOPD提供理论基础及新的靶点。但由于本研究阻断miR-34a/HIF-1α的效果研究仅是在细胞水平进行，病例数也不够多，不能完全代表体内的表达情况，需进一步验证。

参考文献:

[12]张凤云,赵志浩,张卓琦.miR-34a对高糖状态下小鼠巨噬细胞系RAW264.7极化及炎性因子分泌的影响[J].基础医学与临床,2023,43:1808-1813.

基金资助:无锡市卫生健康委资助科研项目(Q202047);无锡市第二届“双百”中青年医疗卫生拔尖人才项目(HB2023120);

文章来源:杜敬宇,应站专,侯宾,等.抑制miR-34a减轻慢性阻塞性肺疾病急性加重期炎性反应[J].基础医学与临床,2024,44(12):1670-1677.