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HLA-A基因甲基多态性与维吾尔族饲鸽者肺发生风险的关系

2024-04-28 46 上传者：管理员

摘要：目的研究南疆维吾尔族饲鸽者肺发生风险与人类白细胞抗原(HLA)基因甲基多态性的关系。方法选择2019年1月至2021年10月在南疆地区养殖鸟禽类1年以上的维吾尔族饲鸽者，其中维吾尔族患饲鸽者肺的30例作为患病组，30例维吾尔族饲养鸽子未患病为阴性对照组，同时选择维吾尔族健康体检者30例作为正常对照组。抽取空腹静脉血4 ml,离心收集血浆和全血细胞并保存待用。应用Sequenom Mass ARRAY Methylation方法对cg1408363基因甲基化水平进行检测。结果从抗原暴露情况分析，发病患者在抗原中有着较长时间暴露，这表明伴随抗原暴露时间越长，饲养鸽子数量越多，出现饲鸽者肺的可能性越大。患病组CpG岛甲基化位点为10的人数、CpG岛甲基化率20%～40%人数明显高于阴性对照组、正常对照组(P<0.05),不同性别及不同年龄段研究对象的HLA-A基因甲基化状态无明显差异(P>0.05)。对3组HLA-A基因11个CpG位点单位差异进行研究，结果显示HLA-A基因CpG5基因位点上存在差异(Z=-2.102,P=0.028)。结论饲鸽者肺患者HLA-A基因CpG5位点甲基化水平异常降低，HLA-A基因甲基化水平与饲鸽者肺发生有着密切联系。

关键词：
人类白细胞抗原(HLA)-A基因
外源性感染
维吾尔族
过敏性肺炎
饲鸽者肺
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饲鸽者肺是一种外源性感染所导致的过敏性肺炎，新疆维吾尔族中饲鸽人数众多，其中饲鸽者肺的发病率也较高[1]。该病的发生与接触鸟类抗原有着密切关系，但是，在接触外源性抗原患者中，不同地区报道患病率具有很大差异性，这提示饲鸽者肺的发生发展可能与个体基因存在差异有着相关性[2]。研究表明，维吾尔族饲鸽者肺易感与白细胞介素(IL)-2和IL-10基因单核苷酸基因多态性有关[3],目前国外相关研究表明人类白细胞抗原(HLA)基因甲基化与多种自体免疫失衡性疾病有关，例如过敏性哮喘等[4],但是关于HLA基因甲基化与饲鸽者肺易感性还未有明确研究，本研究探讨南疆维吾尔族饲鸽者肺发生与HLA-A基因5位胞嘧啶甲基修饰关系。

1、资料和方法

1.1一般资料

选择2019年1月至2021年10月在南疆地区养殖鸟禽类≥1年的维吾尔族饲鸽者肺患病者，所有患者填写《新疆维吾尔族饲鸽者肺相关分子Th1/Th2失衡的生物学机制的病例对照性研究》的调查表，对患者的吸烟史、饲养鸽子年限、年龄、性别等基线资料进行记录，并由新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重症医学科诊断为鸽子肺地维吾尔族30例作为患病组，30例维吾尔少数民族饲养鸽子未患病为阴性对照组，同时选择在新疆维吾尔自治区人民医院体检中心进行体检的30例健康维吾尔族体检者作为正常对照组。检测所有入组参与者HLA-A基因cg140836位点甲基化状态。纳入标准：患病组和阴性对照组均为饲养鸽子1年以上的维吾尔族人；患者符合饲鸽者肺诊断标准；年龄28～77岁。正常对照组为同期在新疆维吾尔自治区人民医院进行体检的健康维吾尔族人。排除标准：(1)患者有恶性肿瘤、自身免疫疾病、风湿免疫系统疾病、急性呼吸窘迫综合征、支气管哮喘、慢性支气管炎、特发性间质性肺炎和类风湿关节炎等疾病。患病组男20例，女10例，平均年龄(52.93±11.93)岁；阴性对照组男18例，女12例，平均(51.84±12.81)岁；正常对照组男21例，女9例，平均年龄(51.63±10.93)岁。3组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2诊断标准

参考过敏性肺炎诊断标准对患者进行诊断，最常应用为Raghu等[5]提出标准。主要标准如下：①患者存在饲鸽者肺相应症状(头痛、四肢酸痛、呼吸困难、寒战、发热、胸闷和干咳等);②患者血清沉淀和病史的抗体的特异性抗原暴露；③患者高分辨率CT和胸部平片CR存在气体陷闭造成的马赛克征象、磨玻璃影间或伴实及细支气管中心结节；④患者支气管肺泡灌洗液(BALF)淋巴细胞有40%以上增加；⑤患者存在淋巴细胞渗出为主的肉芽肿组织、细支气管炎和间质性肺炎；⑥患者在可疑环境暴露后有刺激阳性反应可能性，患者离开此环境可改善；⑦患者经过肺部听诊发现肺底部在吸气时有爆裂声；⑧患者肺功能一氧化碳出现弥散量降低及低氧血症。患者在1～6项标准中出现4项及以上及7～8项标准中1项则诊断为饲鸽肺。

1.3样品收集

抽取患者空腹静脉血4 ml,放于枸橼酸钠抗凝剂中，离心(2 500 r/min,离心半径10 cm)15 min收集血浆及血细胞储存在-80℃冰箱中。

1.4主要试剂和设备

DNA抽提试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit, QIAGE,产品号51304);EZ DNA甲基化试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit, ZYMO,产品号D5005);聚合酶链反应(PCR Accessory Set,美国SEQUENOM公司，产品号11327);masscleave试剂盒(MassCLEAVE Kit,美国SEQUENOM公司，产品号(10129.);分光片芯片序列和清洁树脂盒(美国SEQUENOM公司，产品号10117)。

分光光度计(型号ND-100,Nano Drop);离心机(型号Microfuge 16,Beckman)、离心机(型号PK121,ALC);聚合酶链反应(PCR)仪器(型号96孔，BIORAD);S1000tm热循环仪(型号384孔，BIORAD);移液器单通道(型号P2.5、P20、P200、P1000,Eppendorf);电子移液器24通道(型号P2-20,Rainin);MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(型号RS1000,美国SEQUENOM公司);BCD-218A低温冰箱(青岛海尔公司)。

1.5实验方法

应用Sequenom MassARRAY Methylation方法对患者cg1408363基因甲基化水平进行检测。具体检测过程包括：亚硫酸氢盐转化、PCR扩增、体外转录和RNAse A特异性酶切和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术(MALDI-TO)。主要是将DNA模板CpG甲基化状态转变成RNA酶切片段的序列差别，通过质谱判断分子量的差异进行区分。cg14018363上游引物：5′-GAGTAGTTGAGAGTTTATTTGGATGGT-3′,长度27 bp,下游：5′-TTATCTCCCCTCCTTATAAAAAACC-3′,长度25 bp,检测片段序列(TargetSequence):5′-GAGCAGTTGAGAGCCTACCTGGATGGCACGTGCGTGGA-GTGGCTCCGCAGATACCTGGAGAACGGGAAGGAGA-CGCTGCAGCGCACGGGTACCAGGGGCCACGGGGC-GCCTCCCTGATCGCCTGTAGATCTCCCGGGCTGGC-CTCCCACAAGGAGGGGAGACAA-3′,长度164 bp,检测片段的CpG位点总数：11个，修饰后的上游引物：5′-AGGAAGAGAGGAGTAGTTGAGAGTTTATTTGGA-TGGT-3′,下游：5′-CAGTAATACGACTCACTATAGGGA-GAAGGCTTTATCTCCCC-TCCTTATAAAAAACC-3′。cg14018363基因甲基化状态的质控方法：(1)当DNA被亚硫酸盐处理时，预先完成的CT Conversion Reagent要适当混匀后孵育，努力避开阳光；加完缓冲液后，在离心前要及时更替封口膜，以防残留液体污染；(2)为保证反应体系浓度均匀，PCR扩增及其他反应加样及分装混合液要摇晃均匀；(3)已经拆封的芯片真空保存最多2 h。

1.6甲基化状态评分

甲基化状态评分：以CpG位点甲基化个数评分(≤3个计1分，4～5个计2分，≥6个计3分)和平均甲基化率评分(<20%计1分，20%～40%计2分，>40%计3分)加和来作为甲基化状态评分，总分2～12分，根据评分分为3组(≤3分，4～5分和≥6分)。

1.7统计学分析

采用SPSS19.0软件进行Mann-Whitney U检验、χ2检验或精确概率法。

2、结果

2.1抗原暴露时间分析

患病组和阴性对照组中长期(≥30年)饲养鸽子且饲养数量1 000只以上9 vs 5例，饲养时间15～29年而且饲养数量500只以上10 vs 5例，家庭散养(10～14年)且饲养数量在100只左右6 vs 10例，业余爱好饲养者(5～9年)且养殖数量10只左右5 vs 10例；从抗原暴露情况分析，发病患者在抗原中有着较长时间暴露，这表明伴随患者抗原暴露时间越长，饲养鸽子数量越多，患者出现饲鸽者肺的可能性越大(Z=3.560,P=0.026)。

2.2 3组HLA-A基因甲基化的检测

患病组和阴性对照组CpG甲基化位点数均为8～11个；患病组CpG甲基化位点数为10个的人数、CpG甲基化率为20%～40%的人数明显高于阴性对照组、正常对照组(P<0.05)。见表1。

表1 3组HLA-A基因甲基化CpG位点数和甲基化率比较(n,n=30)

2.3 3组HLA-A基因甲基化状态比较

患病组、阴性对照组和正常对照组HLA-A甲基化状态(≤3分2、3、3例，4～5分26、20、18例，≥6分2、7、9例)差异无统计学意义(χ2=6.208,P=0.184)。

2.4 3组性别、年龄与HLA-A基因甲基化状态的比较

不同性别及年龄段参与者的HLA-A基因甲基化状态无明显差异(P>0.05)。见表2。

2.5 3组CpG岛11个CpG位点甲基化率的比较

对3组HLA-A基因11个CpG位点单位差异进行研究，筛选甲基化差异CpG单位，筛选发现3组CpG单位为非正态分布，HLA-A基因CpG5基因位点上存在差异(Z=-2.102,P=0.028)。CpG1/2、CpG3、CpG4、CpG6、CpG7、CpG8/9、CpG10、CpG11基因位点上差异均无统计学意义(Z=0.000、-0.159、-0.196、-0.371、-1.404、-1.201、-1.092、-0.015,P值=1.000、0.882、0.812、0.709、0.160、0.229、0.892、0.974)。

表2 3组性别、年龄与CpG岛甲基化状态(n)

3、讨论

饲鸽者肺主要是由于患者个人高强度、高频率且长期与鸟禽及宠物的代谢分解产物接触而导致的一种肺泡壁、肺泡囊管和周围支气管远端发生超敏免疫反应所造成的一种过敏性肺炎或过敏性肺泡炎[6,7,8]。饲鸽者肺患者主要会出现：(1)肉芽肿型炎；(2)周围边缘肺组织炎症；(3)肺间质组织出现渗出炎症。饲鸽者肺发病的主要原因为T细胞中介的Ⅳ型超敏反应及免疫循环复合物所造成的Ⅲ型超敏反应[9,10]。患者发病初期主要为循环免疫复合物出现堆积从而造成自身免疫反应，患者病情出现持续发展后会出现T淋巴细胞等细胞增生，患者逐渐发展成为细胞免疫为主的免疫反应[11,12]。

饲鸽者肺的发病机制还尚未研究清楚，HLA作为一个复杂的基因，其在6号染色体臂上有着紧密连锁的碱基，HLA基因可依据基因编码产物不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三种基因，前期研究表明，多种免疫相关疾病均与HLA有着相关性[13]。其中HLA-Ⅰ类基因中又包含有A、B、C、F、G等多个位点，其中HLA-A在抗原递呈细胞、外源性过敏性抗原及T淋巴细胞之间起着介导关系，其在机体的免疫应答中发挥着重要的作用，HLA-A基因甲基化会对其翻译过程产生影响，其中低甲基化会加强RNA转录和蛋白质翻译过程，造成细胞因子大量生成，进而参与抗原抗体复合物生成[14,15,16]。

本研究结果提示，维吾尔族饲鸽者肺患者的HLA-A基因启动子区的甲基化水平较低，从其功能分析，低甲基化状态对基因转录激活有着促进作用，从而造成蛋白质基因转录和翻译异常，从而影响抗原递呈细胞及外源性过敏性抗原与T细胞的链接作用更为强大，从而造成T细胞介导Ⅳ型免疫反应和Ⅲ型免疫反应，从而影响饲鸽者肺的发生和发展[17]。但是，本研究结果表明，饲鸽肺患者和阴性对照组与正常对照组的总体甲基化状态相似，这可能是由于饲鸽者肺患者虽然CpG位点甲基化数目和其甲基化率均低于正常对照组和阴性对照组，但是研究对象并没有出现完全无甲基化，研究对象仅存在少量位点甲基化水平降低，饲鸽肺患者仍然存在CpG位点甲基化。本研究与国外研究[18]结果证明的饲鸽者肺患病率与患者年龄和性别无明显关系，提示患者基因甲基化状态只受自身基因序列影响并不会受患者性别和年龄影响。本研究提示，饲鸽者肺患者在接触鸽子分解分泌物后期HLA-A基因CpG5为基因的甲基化水平出现降低，而且该位点基因甲基化水平降低后会影响HLA-A基因转录和翻译过程，让其表达更为活跃[19]。

维吾尔族饲鸽者肺高发是由多种因素共同导致，而且目前空气中小分子物质及宠物身上脱离的尘螨存在我们生活周边，其饲鸽者肺患者数量越来越多[20]。综上，HLA-A基因甲基化与饲鸽者肺存在密切关系。但是本研究纳入患者数量较少，可能存在一定的偏倚性，后期应进一步扩大样本，研究影响CpG5位点基因甲基化的各种影响因素，降低患者出现低甲基化的可能性，从而降低饲鸽者肺发生的风险。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金(81260003);

文章来源:王金芳,邬超,杨晓红.HLA-A基因甲基多态性与维吾尔族饲鸽者肺发生风险的关系[J].中国老年学杂志,2024,44(08):1828-1831.