溃疡性结肠炎是一种好发于结肠黏膜下层的慢性复发性疾病。临床治疗一般使用抗炎药物和免疫抑制剂，但易发生不良反应[1],所以亟需寻找有效治疗方法。罗哌卡因属长效氨基酰胺类药物，是临床常用局部麻醉药，可参与炎性细胞的生物学行为。罗哌卡因可用于髌骨骨折固定术后镇痛并降低局部炎性反应[2],减轻大鼠骨关节炎组织中炎性因子水平[3]。但罗哌卡因对溃疡性结肠炎的研究鲜有报道。核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白3[nucleotide oligomerization domain (NOD) -like receptor protein 3,NLRP3]炎性小体和核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路被证实在多种包括结肠炎在内的炎性疾病中发挥重要作用。健脾调肠汤可以通过阻碍促炎介质的分泌释放缓解溃疡性结肠炎小鼠模型肠道的炎性损伤，或与抑制NLRP3活化有关[4]。黄芩素可抑制NLRP3激活，抑制溃疡性结肠炎小鼠模型的炎性发应发展[5]。葛根芩连汤可降低NF-κB蛋白表达[6],提示其可抑制NF-κB通路激活来阻断溃疡性结肠炎发生。罗哌卡因对NLRP3炎性小体激活有抑制作用[7],可通过抑制NF-κB信号通路减轻RAW 264.7细胞的丝裂原活化蛋白激酶和凋亡[8]。然而，目前罗哌卡因抑制NLRP3炎性小体和NF-κB通路调控溃疡性结肠炎的结肠上皮细胞的作用报道较少。脂多糖(lipolyaccharide, LPS)诱导的白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)的释放与人结肠上皮细胞损伤有关。LPS刺激细胞24 h可建立溃疡性结肠炎模型[9]。本研究旨在揭示罗哌卡因在结肠炎中的作用，并通过LPS诱导人结肠上皮细胞系NCM-460建立体外炎性模型，探究罗哌卡因对LPS环境下NCM-460细胞炎性反应、增殖和凋亡的影响以及可能的作用机制，为溃疡性结肠炎治疗提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：

人结肠上皮细胞系NCM-460(工业微生物菌种工程技术研究中心)。

1.1.2 药品与试剂：

罗哌卡因(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥98%);LPS(上海源叶生物科技有限公司，纯度≥98%);胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM-H培养基(Gibco公司);NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082[10]、NF-κB通路激活剂Prostratin[11](Sigma-Aldrich公司);酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent, ELISA)试剂盒(初态生物公司);细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(翌圣生物公司);Hoechst 33258染色试剂盒(凯基生物公司);5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒(生工生物工程股份有限公司);鼠抗人细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、NLRP3、NF-κB、磷酸化p-NF-κB及β-actin一抗和山羊抗鼠及兔IgG(碱性磷酸酶标记)二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组与转染：

将细胞分为：①对照组(control, 不干预)、模型组(model, 10 μg/mL LPS[11]干预24 h)、低/中/高浓度组(0.5、1、1.5 mmol/L罗哌卡因干预模型组)、罗哌卡因组(1.5 mmol/L罗哌卡因干预模型组)、罗哌卡因+抑制剂组(1 μmol/L BAY 11-7082干预罗哌卡因组)、抑制剂组(1 μmol/L BAY 11-7082干预模型组)、罗哌卡因+激活剂组(1 μmol/L Prostratin干预罗哌卡因组)。复孔3个，置培养箱(37 ℃,5% CO2)24 h。

1.2.2 CCK-8法测定NCM-460细胞活力：

细胞接种于96孔板中，接种密度为1×104个/孔。细胞分组同1.2.1。分别处理24 h后，各孔加入10%(v∶v)CCK-8溶液；细胞与CCK-8试剂在37 ℃,5% CO2培养箱中孵育培养2 h后，在酶标仪上检测各孔细胞在450 nm处的吸光度(absorbance,A)值，计算细胞活力。细胞活力(%)公式为处理组A值占对照组A值的百分比。

1.2.3 ELISA法检测炎性因子水平：

将NCM-460细胞接种到12孔板中，每孔加约1×105个细胞，药物作用24 h后，根据ELISA试剂盒(IL-6、IL-8和TNF-α)说明书操作，参照对照标准曲线(450 nm处的A值),计算细胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α水平。

1.2.4 EdU法测定NCM-460细胞的增殖能力：

参照EdU试剂盒说明书对各组细胞进行染色后拍照，获取EdU染色的增殖细胞(红色)、Hoechst染色的所有活细胞(蓝色)及合并后的细胞图像。并用Image-J 1.8.0软件进行细胞数目确定。增殖率(%)=红色细胞数/蓝色细胞数×100%。

1.2.5 Hoechst 33258染色法测定NCM-460细胞的凋亡率：

将细胞接种于24孔板，当细胞汇合度达到80%时，接受药物处理；24 h后，细胞与10%(v∶v)Hoechst 33258工作液避光孵育10 min。Hoechst 33258荧光信号在荧光显微镜下观察并拍照。高强蓝色信号为凋亡细胞，低弱蓝色信号为正常细胞。细胞凋亡率(%)=(凋亡细胞数/总的细胞数)×100%。

1.2.6 Western blot测定细胞中cyclin D1、caspase-3、NLRP3及NF-κB蛋白表达：

细胞接种于6孔板，接种密度为1×105个/孔。各组细胞在药物作用24 h后，被RIPA裂解液重悬并裂解；在4 ℃,12 000 r/min离心10 min后收集上清液，即总蛋白样品。蛋白样品先经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(80～120 V恒压法)进行蛋白分离，再经过电泳法(300 mA恒流法)进行蛋白转膜。载有蛋白的PVDF膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h后，在4 ℃进行一抗孵育过夜或室温一抗孵育2 h; 接下来，进行室温二抗孵育2 h。封闭、一抗孵育、二抗孵育和显影之间分别用Tris洗膜缓冲液进行3～5次膜洗涤。使用凝胶成像系统拍照记录，并用ImageJ软件进行蛋白吸光度分析。

1.3 统计学分析

计量资料以均值±标准差

表示，多组间比较利用单因素方差分析。数据分析使用SPSS 26.0软件进行，P<0.05认为有显著性差异。作图软件为GraphPad Prism 8,增殖、凋亡细胞数和蛋白吸光度值计算用Image J 1.8.0进行。

2、结果

2.1 罗哌卡因对LPS诱导的NCM-460细胞活力的影响

模型组细胞活力较对照组降低(P<0.05);高浓度组细胞活力较模型组上升(P<0.05),因此选择高浓度组为罗哌卡因组进行后续实验(图1)。

图1 各组细胞活力比较

2.2 罗哌卡因和NF-κB信号活化状态对LPS诱导NCM-460细胞炎性因子水平的影响

采用ELISA法检测了各组NCM-460细胞裂解液中IL-6、IL-8和TNF-α水平，模型组IL-6、IL-8和TNF-α水平较对照组上升(P<0.05);罗哌卡因组和抑制剂组IL-6、IL-8和TNF-α水平较模型组降低(P<0.05);罗哌卡因+抑制剂组IL-6、IL-8和TNF-α水平较罗哌卡因组下降(P<0.05);罗哌卡因+激活剂组IL-6、IL-8和TNF-α水平显著升高(P<0.05)(图2)。

2.3 罗哌卡因和NF-κB信号活化状态对LPS诱导的NCM-460细胞的增殖能力的影响

模型组细胞增殖率低于对照组(P<0.05);罗哌卡因组和抑制剂组细胞增殖率高于模型组(P<0.05);罗哌卡因+抑制剂组细胞增殖率高于罗哌卡因组(P<0.05);罗哌卡因+激活剂组细胞增殖率低于罗哌卡因组(P<0.05)(图3)。

2.4 罗哌卡因和NF-κB信号活化状态对LPS诱导NCM-460细胞凋亡的影响

模型组细胞凋亡率高于对照组(P<0.05);罗哌卡因组和抑制剂组凋亡率低于模型组(P<0.05);罗哌卡因+抑制剂组凋亡率低于罗哌卡因组(P<0.05);罗哌卡因+激活剂组凋亡率高于罗哌卡因组(P<0.05)(图4)。

2.5 罗哌卡因和NF-κB信号活化状态对LPS诱导的NCM-460细胞增殖凋亡及炎性小体的影响

模型组cyclinD1蛋白水平低于对照组(P<0.05),caspase-3和NLRP3水平高于对照组(P<0.05);罗哌卡因组和抑制剂组cyclinD1蛋白水平高于模型组(P<0.05),caspase-3和NLRP3水平低于模型组(P<0.05);罗哌卡因+抑制剂组cyclinD1水平高于罗哌卡因组(P<0.05),caspase-3和NLRP3水平低于罗哌卡因组(P<0.05);罗哌卡因+激活剂组cyclinD1水平低于罗哌卡因组(P<0.05),caspase-3和NLRP3水平高于罗哌卡因组(P<0.05)(图5)。

图2 Elisa检测各组炎性因子水平

图3 罗哌卡因及NF-κB调节剂对人结肠上皮细胞系NCM-460增殖的影响

2.6 罗哌卡因和NF-κB信号活化状态对LPS诱导的NCM-460细胞中NF-κB和p-NF-κB蛋白表达量的影响

模型组p-NF-κB水平高于对照组(P<0.05);罗哌卡因组和抑制剂组p-NF-κB蛋白水平低于模型组(P<0.05);罗哌卡因+抑制剂组p-NF-κB水平低于罗哌卡因组(P<0.05);罗哌卡因+激活剂组p-NF-κB水平高于罗哌卡因组(P<0.05)(图6)。

3、讨论

溃疡性结肠炎为一种慢性炎性疾病，常规药物疗效不明显。因此，探寻新的治疗策略至关重要。罗哌卡因常用于手术麻醉，可抑制促炎因子表达，起抗炎作用。研究显示，罗哌卡因能抑制巨噬细胞系RAW 264.7细胞的丝裂原活化蛋白激酶、NF-κB信号通路和凋亡， 缓解PM 2.5诱导的人正常肺上皮细胞BEAS-2B活力和炎性反应[12]。但罗哌卡因对溃疡性结肠炎相关的结肠上皮细胞的作用和机制鲜有报道，因此本实验通过罗哌卡因作用LPS诱导的NCM-460炎性模型，探究其对LPS诱导的NCM-460炎性反应的作用。本研究发现高浓度罗哌卡因可明显缓解LPS诱导NCM-460细胞炎性损伤，抑制细胞活力减弱，因此本研究选取1.5 mmol/L浓度罗哌卡因用于后续实验。

图4 罗哌卡因及NF-κB调节剂对人结肠上皮细胞系NCM-460凋亡的影响

图5 各组cyclinD1、caspase-3和NLRP3蛋白表达量的比较

图6 各组NF-κB和p-NF-κB蛋白表达量的比较

后续实验中，LPS诱导后细胞炎性因子IL-6、IL-8、TNF-α表达水平、凋亡能力及caspase-3、NLRP3蛋白表达水平增加，增殖能力和cycilnD1蛋白水平下降；在建模基础上加罗哌卡因后这些指标趋势变化正好相反，说明罗哌卡因能显著抑制LPS诱导的NCM-460细胞NLPR3炎性小体激活、炎性反应、凋亡，促进其增殖。NF-κB在NCM-460细胞中的磷酸化水平可被LPS显著上调，而罗哌卡因可抑制LPS诱导的NF-κB磷酸化水平，提示罗哌卡因可能通过抑制该通路的活化从而抑制LPS诱导的NCM-460细胞损伤。NF-κB信号通路在细胞的免疫调节和炎性反应中起关键作用，其异常调节会引发自身免疫疾病、炎性反应和多种肿瘤发生。足细胞中NF-κB通路和NLRP3炎性小体被抑制时，高糖诱导的足细胞损伤和焦亡得到缓解[13]。香连丸可能通过调控NF-κB信号通路来治疗溃疡性结肠炎[14]。甘露多糖可通过抑制NF-κB炎性通路改善溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜屏障[15]。为了进一步探究NF-κB通路在罗哌卡因调节LPS诱导的NCM-460细胞功能中的参与程度，将NF-κB通路抑制剂作用于LPS诱导NCM-460细胞。加入抑制剂后显著降低了细胞中p-NF-κB的蛋白表达量，减轻了LPS诱导的NCM-460细胞炎性损伤和凋亡，促进了增殖，与罗哌卡因作用效果相似，说明LPS诱导激活了NF-κB通路，而NF-κB通路抑制剂和罗哌卡因均能阻断LPS诱导的NCM-460细胞中NF-κB通路的信号转导。随后将NF-κB通路抑制剂和激活剂分别结合罗哌卡因作用于NCM-460细胞，发现NF-κB通路抑制剂可进一步抑制细胞的IL-6、IL-8、TNF-α表达水平、凋亡能力、caspase-3、NLRP3、p-NF-κB蛋白水平，进一步增强增殖能力和cycilnD1蛋白水平，说明NF-κB通路抑制剂可加深罗哌卡因对LPS诱导的NCM-460细胞损伤的保护作用；而NF-κB通路激动剂则削弱了罗哌卡因在LPS诱导的炎性环境下对NCM-460细胞功能的保护作用。

综上，罗哌卡因抑制LPS诱导的NCM-460细胞凋亡，促进增殖，NF-κB通路可能参与其作用。接下来应深入研究罗哌卡因是否通过其他分子机制减缓结肠细胞损伤，为溃疡性结肠炎的治疗提供更多的理论依据。

参考文献:

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基金资助:国家卫生健康委员会“十四五”规划全国重点课题(YYWS4176);

文章来源:周灵琴,王伟娟,任玲玲,等.罗哌卡因减轻LPS诱导的人结肠上皮细胞系NCM-460凋亡[J].基础医学与临床,2024,44(10):1368-1375.