摘要:目的 观察三七白及粉对脑出血致应激性溃疡(SU)模型大鼠的治疗作用,并探讨其作用机制。方法 将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、三七白及粉组,每组10只。适应性饲养1周后,模型组、三七白及粉组采用自体血定位注射法建立大鼠基底节脑出血致SU模型。在造模完成3天后,三七白及粉组予三七白及粉2.5 g/kg灌胃,对照组、模型组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,连续灌胃14天后,将大鼠麻醉后取血,检测大鼠血清一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、前列腺素E2(PGE2)水平。取完整胃组织观察形态学改变,取脑组织和胃溃疡组织进行切片,并采用苏木素-伊红(HE)染色法观察脑组织和胃组织病理变化,并测定溃疡指数。结果 与对照组比较,模型组大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均降低(P<0.05),MDA升高(P<0.05);与模型组比较,三七白及粉组大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均升高(P<0.05),MDA降低(P<0.05)。脑组织病理学观察:基底节区细胞排列不规则,细胞核形态不规则,部分出现核皱缩现象,血肿及周围神经元减少,胶质细胞、毛细血管增生明显。胃组织形态观察:对照组大鼠胃黏膜表面光滑,色淡红,并覆盖有大量黏液,黏膜表面及浆膜面完整,未见水肿、充血等病理变化;模型组可见大量散在点、线状出血或糜烂,并伴有炎性渗出;三七白及粉组大部分可以找到溃疡灶,但面积较小,部分可见充血点及炎性渗出物。胃组织病理观察:对照组胃黏膜组织形态正常,结构完整;模型组胃黏膜镜下可见胃黏膜上皮细胞坏死、脱落,腺体结构破坏,黏膜间质明显充血、水肿和出血;三七白及粉组胃黏膜表面未见糜烂,间质充血、水肿程度较模型组明显减轻。三七白及粉组大鼠溃疡指数低于模型组(P<0.05)。结论 三七白及粉能促进脑出血致SU胃黏膜愈合修复,其作用机制可能是经过提高消化道黏膜保护因子PGE2、NO水平,增强SOD活性,降低MDA水平,增强抗氧化应激作用,进而加强胃黏膜的防御修复能力实现的。
应激性溃疡(stress ulcer, SU)是指机体在应激状态下发生的急性胃肠道黏膜糜烂、溃疡等病变,严重者可并发消化道出血甚至穿孔,可使原有疾病的程度加重及恶化,增加病死率[1]。预防SU是救治危重症患者不可忽视的环节[2]。SU是脑出血的主要并发症之一,据相关文献记载,颅脑出血后SU发生率高达16%~47%[3]。研究证实,三七、白及可直接作用于消化道出血部位,加速血液凝固,收敛出血部位的创面,消除炎症、水肿,加快出血伤口愈合[4]。本实验研究通过观察三七白及粉对脑出血致SU大鼠的治疗作用,并探讨其可能作用机制,为临床应用提供根据。
1、材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性SD大鼠30只,体质量(200±5)g, 8~10周龄,来源于河北医科大学动物中心。动物生产许可证号:SCXK(冀)2008-1-003。饲养环境温度控制在20~25 ℃,相对湿度40%~65%,光照时间12 h/d, 循环通风换气。
1.2 药物及试剂
三七白及粉混悬液的制备:将三七(广东一方制药有限公司,批号:ZZS0020)、白及(广东一方制药有限公司,批号:ZZB0110)颗粒剂按照1∶1比例调匀。根据临床70 kg体质量人的用药量换算给药用量,根据动物体表面积比率折算等效药量,溶入0.9%氯化钠注射液制备相应浓度混悬液,并折算出给药剂量(2.5 g/kg),给药容积为1 mL/100 g。试剂:前列腺素E2(PGE2)试剂盒(上海研谨生物科技有限公司,批号:20170621);丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司,批号:20161103);一氧化氮(NO)测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司,批号:20170528);超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程有限公司,批号:20170715)。
1.3 仪器
双目光学显微镜(日本Olympus公司),大鼠脑立体定位仪(美国STOELTING公司),TGL-16G-A型低温高速离心机(上海手术器械厂),DK-600A型电热恒温水箱(上海一恒科技有限公司),MDF-382E型超低温冰箱(日本三洋公司),HM-200电子天平(日本三洋公司),WH-43电热恒温干燥箱(天津泰斯特仪器公司),YXQG02型电热式蒸气消毒器(山东新华医疗器械厂),UV755B型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),石蜡切片机(德国Leica公司)。
1.4 方法
1.4.1 分组及动物模型制备
将大鼠随机分为3组:对照组、模型组、三七白及粉组。适应性饲养1周后,模型组、三七白及粉组采用自体血定位注射法建立大鼠基底节脑出血致SU模型。以10%水合氯醛将模型组、三七白及粉组大鼠进行腹腔麻醉。待麻醉成功后,将大鼠俯卧位固定,头顶部脱毛处理,放置于大鼠脑立体定位仪下。用碘酒消毒头顶脱毛部,以酒精脱碘后。将头顶部铺孔巾以暴露术野,沿顶正中线右侧0.5 cm眼耳连线间将皮肤切开1 cm, 将颅骨皮下筋膜钝性分离。定位(前囟前0.2 mm, 正中旁开3.0 mm)后以颅钻打孔,直径为1 mm。于大鼠尾静脉处抽取自体血200 μL,抽取后立即从颅顶钻孔处垂直进针约6 mm, 于右脑基底节区处用微量泵泵入自体血(5 μL/min)。注射完毕后留针10 min后缓慢出针5 min。缝合皮肤切口,于切口处涂抹碘酒消毒后将大鼠置笼内观察。在大鼠脑出血模型制备6 h后,使用Longa评分法[7]进行评分:0分,无任何明显体征;1分,对侧肢体不能完全伸展;2分,对侧肢体瘫痪,向对侧转圈,有追尾现象;3分,行走时向对侧倾倒;4分,有意识障碍。2分以上者认为造模成功。死亡和造模不成功者排除。
1.4.2 灌胃给药
在造模完成后第3天开始灌胃给药,三七白及粉组予2.5 g/kg的三七白及粉混悬液灌胃,给药容积为1 mL/100 g。对照组和模型组分别给予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,连续灌胃14天。
1.5 观察指标及方法
1.5.1 血液指标
在末次给药2 h后,经大鼠下腔静脉取血4 mL。其中取1 mL,注入加有0.5 mL消炎痛-EDTA-Nat液的抗凝试管内,以3000 r/min离心10 min, 取上清液,-20 ℃保存备用,检测PGE2。另取血3 mL置于不抗凝试管中,以2500 r/min离心15 min, 取上清液,测NO、SOD及MDA。方法按试剂盒说明书操作
1.5.2 组织形态观察
①取脑组织:经下腔静脉取血后,处死大鼠,完整取出大鼠脑组织。②胃组织形态观察:胃注入1%甲醛溶液8 mL并结扎幽门、贲门后提取整个胃组织,浸入1%甲醛溶液中10 min, 用手术剪沿胃大弯切开整胃,随后展开铺平,经0.9%氯化钠注射液冲洗干净后,沿溃疡周围切掉胃壁(保留溃疡边缘3 mm周围组织),观察大体形态和胃溃疡条数。将长轴的中点沿溃疡中心纵向切取一分为二备用。
1.5.3 病理学观察
用中性甲醛固定所取的脑及胃溃疡组织24 h, 脱水后进行石蜡包埋、切片并苏木素-伊红(HE)染色。HE染色方法:用甲苯-无水酒精脱去石蜡,然后经过无水酒精、70%酒精、50%酒精依次过渡到水。后经苏木精液染色5 min, 后以蒸馏水流水清洗掉苏木精液,然后1%盐酸乙醇溶液分色。后以淡氨水冲洗,再用蒸馏水温和清洗。1%伊红染液染色5~10 min比照染色,提取切片,用蒸馏水清洗脱去浮色。后经酒精等级脱水,直接用碳酸二甲苯透明,将中性树胶封片,后镜检。
1.5.4 溃疡指数测定
按Guth[8]标准计算,溃疡指数=每组动物胃黏膜溃疡长度×宽度的和/每组动物数。评分标准:斑点糜烂记1分;糜烂长度<1 mm记2分;≥1 mm, <2 mm记3分;≥2 mm, <3 mm记4分,依次类推。宽度>2 mm, 分值×2。
1.6 统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析,计量资料用均数±标准差表示,组间比较采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 各组大鼠血清NO、MDA、SOD、PGE2水平比较
与对照组比较,模型组大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均降低(P<0.05),MDA升高(P<0.05);与模型组比较,三七白及粉组大鼠血清NO、SOD和PGE2水平均升高(P<0.05),MDA降低(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠血清NO、MDA、SOD、PGE2水平比较
2.2 脑组织病理观察
大鼠脑组织病理观察:基底节区细胞排列不规则,细胞核形态不规则,部分出现核皱缩现象,血肿及周围神经元减少,胶质细胞、毛细血管增生明显。见图1。
2.3 各组大鼠胃组织形态观察
对照组大鼠胃黏膜表面光滑,色淡红,并覆盖有大量黏液,黏膜表面及浆膜面完整,未见水肿、充血等病理变化。模型组可见大量散在点、线状出血或糜烂,并伴有炎性渗出。三七白及粉组大部分可以找到溃疡灶,但面积较小,部分可见充血点及炎性渗出物。见图2。
图1 大鼠脑组织病理学图片(HE染色,×100)
图2 各组大鼠胃组织形态
2.4 各组大鼠胃组织病理观察
对照组胃黏膜组织形态正常,结构完整;模型组胃黏膜镜下可见胃黏膜上皮细胞坏死、脱落,腺体结构破坏,黏膜间质明显充血、水肿和出血;三七白及粉组胃黏膜表面未见糜烂,间质充血、水肿程度较模型组明显减轻。见图3。
图3 各组大鼠胃黏膜组织病理学图片(HE染色,×40)
2.5 各组大鼠溃疡指数比较
三七白及粉组大鼠溃疡指数低于模型组(P<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠溃疡指数比较
3、讨论
SU是脑出血最常见的并发症之一。其发生、发展、转归及预后是一个非常复杂的病理生理过程。有研究推测可能脑出血量越大,脑水肿越严重,病变范围越广,越容易发生SU,消化道黏膜血流量减少,缺血缺氧致急性糜烂、溃疡、出血[5]。
中医学无SU的病名,但是与中风、吐血、便血等相对应。中医学认为,脑出血所致SU以“颅脑损伤,心神失养,脾胃升降失调,气滞血瘀,郁而化热,迫血妄行而致出血”为病因病机。本研究通过制备脑出血致SU模型,并制作脑组织病理切片,发现脑组织形态显著改变。此外,胃溃疡指数显著增加,经过对胃组织HE染色后,结果也证实了这一发现,从而进一步确认了模型制备成功。本研究旨在通过对脑出血致SU大鼠进行治疗干预,以探索有效的治疗方法。
在《本草求真》《濒湖集简方》《本草新篇》等古籍均有口服三七、白及粉剂治疗急性消化道出血性疾病的记载。白及消肿生肌,收敛止血;三七散瘀止血,改善循环。两药联用,一散一收,在止血的同时,可以改善创伤临近组织的微循环,促进愈合[6]。有学者研究结果表明,三七白及粉类方剂与西药联合治疗消化性溃疡的效果明显优于单独使用西药治疗[7]。本研究采用三七白及粉干预脑出血致SU大鼠,结果显示,与模型组比较,三七白及粉组能够明显降低黏膜溃疡的发生,且溃疡指数明显降低(P<0.05)。这说明三七白及粉对脑出血致SU的胃黏膜有治疗作用。
消化道出血是脑出血的常见并发症之一,因脑血管意外所引起的SU,在临床表现、治疗方法及预后方面有着不同于其他SU的特点。本实验主要探讨三七白及粉促进脑出血致SU愈合的可能的作用机制。SU的发病机制涉及血液微循环不足,随后导致组织低氧血症和氧化应激,以及氧自由基的积累。氧自由基会破坏细胞蛋白质(包括DNA 和脂质)的化学结构,并以多种方式诱导细胞死亡。机体通过酶促和非酶促防御机制来防御氧自由基。非酶防御机制通过组织病理学检查评估,酶防御机制通过生化检查评估。NO是血管内皮释放的炎性介质,抗氧化作用显著,可保护胃黏膜[8]。MDA是机体内不饱和脂肪酸在脂质过氧化作用下形成的最终产物,可使细胞变性、坏死[9]。PGE2 和 SOD 是对抗氧化应激介导的胃炎的代表性黏液保护因子。特别是PGE2通过多种机制在维持胃黏膜完整性中发挥重要作用[10,11]。有药物如扎鲁司特能通过PGE2和抗炎途径对吲哚美辛诱导的大鼠胃溃疡起到胃保护作用[12]。鲁斯可皂苷元通过升高PGE2水平对乙酸引起的胃溃疡发挥有效的治疗作用[13]。本次研究中,三七白及粉组治疗后血清MDA水平低于模型组,SOD和NO水平高于模型组,提示三七白及粉能够有效清除氧自由基,提高多种抗氧化因子活性。类似的研究中,三七皂苷处理晚期糖基化终末产物(AGE)诱导的人脐静脉内皮细胞后,MDA的活性降低,SOD活性增加[14]。三七皂苷 R1增加了氧糖剥夺/复氧后周细胞SOD表达[15]。大量文献报道,PGE2与溃疡病的发生关系密切[16,17]。本实验研究结果表现,与对照组相比较,模型组大鼠PGE2含量明显降低,说明脑出血致SU模型的形成可能与PGE2含量降低有关。三七白及粉组PGE2含量高于模型组,提示升高PGE2含量是三七白及粉治疗脑出血致SU的一个途径。三七白及粉通过上调PGE2 、SOD和NO来减少MDA的量。提示PGE2减少在SU发病中有重要意义。而三七白及粉治疗溃疡的机制可能与升高PGE2有关。
综上所述,三七白及粉作为活血化瘀、生肌止痛之良方,对脑出血致SU具有良好的治疗作用,而且作用靶点是多方面的。三七白及粉通过显著提升血清NO含量,以提高胃黏膜血流量,增加黏膜抵抗能力。提高PGE2含量促进胃黏膜血流和胃黏液分泌,以增加胃黏膜表面活性物质,对胃黏膜起到保护作用。提高血清SOD活性,以改善应激状态下胃黏膜的血流量,阻止有害游离基的形成,保护胃黏膜,同时降低脂质过氧化产物MDA水平,促进溃疡愈合。
参考文献:
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基金资助:河北省中医药管理局2019年度中医药类科研计划课题(编号:2019454);
文章来源:安凯,郭沛然,孙玉凤.三七白及粉对大鼠脑出血致应激性溃疡的治疗作用及其机制研究[J].河北中医,2024,46(02):301-305.
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自发性脑出血(sICH)是指脑血管在没有外伤的情况下自发破裂出血,其病情发展迅速,预后不佳,致残和死亡的风险较高[1]。在急性脑血管病中,sICH的致死率最高。在我国sICH的患病风险仍较高,而且不同性别和年龄的人群之间存在明显差异[2]。既往研究[3]发现,女性在45岁后患sICH的风险明显增加。我国大多数女性在45岁左右时即已处于围绝经期。因此,临床中应更重视围绝经期女性患sICH以及其并发症的预防和治疗[4]。
2024-04-25脑出血是一种高风险疾病,可能由外伤、高血压等因素导致。脑出血诊断主要依赖于CT、核磁共振等影像学检查。传统的人工阅片方式存在识别效率不高、结果易受医师的技术水平影响,难以实现大规模诊断等问题。近年来,人工智能技术的进步与发展,特别是深度学习技术在医学影像领域的应用,为脑出血的机器诊断提供了新方法。
2024-04-23自发性脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是指脑实质内非创伤性的血管破裂出血,血肿进入脑实质或脑室,是一种严重的卒中类型,具有高死亡率及高致残率[1]。高血压和脑淀粉样血管病(cerebral amyloid angiopathy,CAA)是自发性ICH的2个主要危险因素[2]。ICH血肿体积大小与患者死亡率和神经功能结局密切相关,清除血肿能够缓解血肿占位效应,降低颅内压,减少血液成分导致的神经毒性作用[3]。
2024-04-22脑卒中疾病有多种类别,其一为高血压脑出血,其致残、致死事件的发生概率高[1]。手术治疗在该患者中较为常用,是通过手术将血肿病灶清除,从而降低颅内压,以减轻神经功能缺损的程度。传统开颅手术是既往治疗高血压脑出血的常用方法,但该术式对患者的身体耐受力有较高的要求。因为此术式会对周围正常脑组织造成损伤,若损伤过大、耐受力不高,有可能加重病情甚至引起死亡等风险事件,且术后康复期的好转率低。因此,该术式在临床上的应用具有局限性[2]。
2024-04-06脑出血在临床较为常见,其病情进展速度快、起病急、发病率高、致死率高[1],因此需及时对患者采取有效的治疗,否则将严重威胁其生命安全。手术治疗通常被认为是有效且直接的方式,而手术时机、方法的不同都会对预后产生程度不同的影响。随着医学技术水平的不断提升,微创手术在诸多科室工作开展中产生了很多积极的价值[2]。
2024-04-03脑出血是一种非外伤性、原发性的严重脑血管出血性疾病,多发生于50~70岁,具有发病率高、发病紧急、病情复杂、预后不佳等临床特征。特别是对于急性脑出血而言,其病死率高达30%~40%,对患者及其家属造成了极大的危害与负担。对急性脑出血患者进行及时有效的护理,有助于提高患者治疗的积极性,改善患者身体机能,预防并发症的发生。
2024-03-30脑出血占急性脑血管病的20%~30%,是急性脑血管病中病死率最高的类型,发病30 d内病死率高达35%~52%,且生存患者中也仅有少数可在6个月内恢复自理生活能力[1,2,3]。因此,康复治疗在脑出血术后康复期尤为重要。脑出血术后恢复期患者的常规康复治疗主要依赖于医务人员协同的被动康复训练模式,训练项目过于统一,缺乏个体化,长期以来患者肢体功能和日常生活能力改善并不显著[4]。
2024-03-21脑出血是死亡率最高的脑卒中亚型,占脑血管疾病的35%,具有高致残、致死率[1,2]。外科手术是治疗脑出血患者的主要手段,可以在一定程度上减轻其原发性损伤,但不能逆转脑出血后的继发性脑损伤。铁死亡是一种铁依赖性非凋亡细胞死亡模式[3],既往对铁死亡的研究多集中于肿瘤领域,但近年来发现在脑出血中也有铁死亡现象[4,5]。
2024-03-12脑出血是死亡率最高的脑卒中亚型,占脑血管疾病的35%,具有高致残、致死率[1,2]。外科手术是治疗脑出血患者的主要手段,可以在一定程度上减轻其原发性损伤,但不能逆转脑出血后的继发性脑损伤。铁死亡是一种铁依赖性非凋亡细胞死亡模式[3],既往对铁死亡的研究多集中于肿瘤领域,但近年来发现在脑出血中也有铁死亡现象[4,5]。
2024-03-11在西方国家,脑出血约占急性脑卒中的15%[1],而我国的脑出血比例较高,占急性脑卒中的18.8%~47.6%[2]。自噬是重要的细胞自我降解反应,以维持细胞内环境的相对稳定[3]。研究表明,脑出血后,脑组织的胶质细胞中自噬途径被激活,其在脑出血后发挥重要的调节作用[4]。脑出血自噬相关的研究逐渐增多,自噬成了脑出血研究的热点之一[5]。
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