急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)是世界范围内心血管疾病患者死亡及致残的主要原因之一，其特征为斑块破裂引起血栓形成和随后的缺氧缺血性损伤[1,2]。心肌细胞凋亡常发生在AMI病理过程中，导致心肌细胞缺失，抑制心肌细胞凋亡成为治疗缺血性心脏损伤和AMI的有效途径[3,4]。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能的细胞，随着近年来相关研究的不断深入，BMSCs被认为是AMI后再生治疗的热点种子细胞，但BMSCs移植后存活率低成为其临床应用的主要障碍之一[5]。BMSCs在生理或病理状态下可分泌一种直径为30～100nm的囊泡，即BMSCs源性外泌体，在心血管领域中，BMSCs外泌体移植治疗具有极高的应用前景。作为AMI新型无细胞疗法，BMSCs外泌体移植相较于BMSCs移植治疗，可减少BMSCs移植术引起的损伤，从而提高移植术后心肌细胞的存活率也能避免移植干细胞意外分化为其他细胞的风险[6,7]。微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)已被证实是多种疾病的有效生物标志物，其在AMI诊治中的潜在价值也一直被挖掘[8,9]。研究[10]发现，miR-22可减少由于缺血引起的心肌细胞凋亡，对缺血性心脏病具有靶向治疗作用。miR-22是参与细胞凋亡调控的重要因子，抑制miR-22使缺氧复氧损伤的心肌细胞凋亡率增加[11]，但其具体作用机制尚未明确。p53在缺血-再灌注损伤导致的心肌细胞凋亡过程中通过介导线粒体凋亡途径发挥关键性作用[12]，而经Targetscan网站预测，发现miR-22与p533'TUR存在结合位点，因此，我们猜想miR-22抑制心肌细胞凋亡的机制可能与靶向调控p53相关，为了验证此猜想，本研究提取富含miR-22的BMSCs源外泌体作用于AMI大鼠，观察其治疗效果并检测p53相关凋亡通路蛋白表达变化。

1、材料与方法

1.1实验材料及试剂

66只清洁级雄性SD大鼠，8周龄，体质量为(200±20)g，购于湖北省动物实验中心[动物合格证编号:SCXK(鄂)2019-0013]。本实验通过南华大学动物福利伦理审批(USC2019001602)。DMEM/F12培养基、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、化学发光试剂购自上海碧云天公司;逆转录试剂盒购自大连TaKaRa公司;SYBRGreenPCR试剂盒购自美国KAPABiosystems公司;外泌体提取试剂盒购自美国SBI公司;PVDF膜购自美国Merckmillipore公司;TUNEL凋亡检测试剂盒购自武汉博士德公司;蛋白提取试剂购自上海生工生物公司;鼠抗CD34-FITC单克隆抗体、鼠抗CD44-FITC单克隆抗体、鼠抗CD90-PE单克隆抗体均购自美国eBioscience公司;兔抗CD63多克隆抗体、兔抗CD81多克隆抗体、兔抗p53多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗Bax多克隆抗体及兔抗Cleavedcaspase-3多克隆抗体均购自英国Abcam公司。miR-22过表达及阴性对照慢病毒载体滴度≥1×108TU/mL，由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

1.2实验方法

1.2.1BMSCs分离与培养

取6只SD大鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下剪去大鼠双侧股骨及胫骨骨骺端，暴露骨髓腔，采用5mL注射器吸取含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲出骨髓，并反复吹打制成单细胞悬液。加入等体积的Percoll分离液，1500r/min离心30min，收集中间细胞层于新离心管中。PBS洗涤，1000r/min离心10min，再加入DMEM/F12完全培养基悬浮细胞，并接种于细胞培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱中培养，3d换液1次，待细胞融合度达85%以上时进行1∶2传代培养。

1.2.2流式细胞仪检测BMSCs表面标志物

收集第3代生长状况良好的BMSCs，经过消化处理后制成单细胞悬液，1200r/min离心5min，调整细胞密度为1×106个/mL。取100μL细胞悬液，分别加入2μL单抗CD34-FITC、CD44-FITC、CD90-PE，冰上避光孵育30min,PBS洗涤3次，加入400μLPBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测。

1.2.3BMSCs成骨诱导分化

收集第3代生长状况良好的BMSCs，按细胞密度为3.5×104个/mL接种于6孔板中，待细胞融合度达到80%时加入成骨诱导液(1mol/Lβ-甘油磷酸钠、1mmol/L地塞米松、50mmol/L抗坏血酸)，每3d换液1次。诱导21d后，弃培养基，加入4%多聚甲醛固定30min,PBS洗涤3次，加入1mL茜素红染液孵育5min,PBS漂洗3次，观察成骨染色效果。

1.2.4miR-22过表达慢病毒载体转染BMSCs

取第3代BMSCs，按细胞密度为4.0×105个/mL接种于6孔板中。将细胞分为三组:BMSCs组、BMSCs/miR-NC组和BMSCs/miR-22组，待细胞融合度达到70%后，按照转染复数值(MOI)=50将miR-NC及miR-22重组慢病毒液分别加于BMSCs/miR-NC组和BMSCs/miR-22组培养基中，继续培养48h。采用qRT-PCR检测转染效率。

1.2.5BMSCs外泌体提取及鉴定

收集各组转染后的BMSCs培养液上清，按照试剂盒说明书加入1/5体积的外泌体提取试剂，4℃静置12h，再1500r/min离心30min，弃上清，加入150μL重悬沉淀。取部分外泌体样品，经透射电子显微镜观察外泌体形态，并采用Westernblot检测外泌体特异性标记蛋白CD63和CD81的表达。外泌体鉴定后，通过qRT-PCR检测各组BMSCs外泌体中miR-22的表达水平。

1.2.6构建AMI大鼠模型及分组干预

将60只SD大鼠随机分为五组:Sham组、AMI组、ExoBMSCs组、ExoBMSCs/miR-NC组和ExoBMSCs/miR-22组，每组12只。腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉，暴露大鼠颈部气管，气管插管连接呼吸机辅助呼吸，呼吸机参数:呼吸频率为90次/min，潮气量为8mL，呼吸比为1∶2。于大鼠胸部左侧第3、4肋骨间手术切口1cm，暴露心脏，在左冠状动脉前降支起始部，采用5-0针线进行结扎，缺血处理30min后，剪开丝线恢复血流灌注。当观察到心电图记录仪上ST段出现明显抬高，且左心室缺血变白，说明AMI模型构建成功。Sham组大鼠仅进行左冠状动脉前降支穿线处理，但不结扎。ExoBMSCs组、ExoBMSCs/miR-NC组和ExoBMSCs/miR-22组大鼠于心肌梗死区域选择4个位点分别注射25μL的外泌体(750mg/mL),Sham组和AMI组在相同位置注射等量的生理盐水。

1.2.7心脏功能检测

分组干预72h后，进行超声心动图监测，分别记录左心室舒张末期内径(LVDd)、左心室收缩末期内径(LVDs)、左心室射血分数(LVEF)及短轴缩短率(FS)。

1.2.8TTC染色观察心肌梗死面积

完成超声心动图监测后，每组随机取5只大鼠，颈椎脱臼处死后，取其心脏，沿着心脏横轴方向进行切片，厚度约为2mm，经2%TCC染液避光染色30min，可观察到红色为正常心肌，白色为缺血梗死心肌，采用Image-ProPlus6.0软件计算心肌梗死面积占切面总面积的百分比。

1.2.9TUNEL法观察心肌细胞凋亡

分组干预72h后取剩余大鼠颈椎脱臼处死，取部分梗死交界区心肌组织，常规石蜡包埋后制备成组织切片，根据TUNEL凋亡检测试剂盒说明书操作，在显微镜下拍照观察，于200倍光镜下随机选取5个视野，统计阳性细胞和总细胞数目，凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.10qRT-PCR检测miR-22及p53mRNA水平

收集细胞或外泌体或梗死交界区心肌组织，提取总RNA，测量RNA纯度。将RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板进行扩增。以U6为内参，检测miR-22表达水平;以GAPDH为内参，检测p53mRNA水平。引物序列如下:miR-22-F:5'-GCACATGCGAATAAGCTGCCAGTTGAAGAA-3',miR-22-R:5'-GACGACCCAGTTATCAGTCCGTTTGGAA-3';U6-F:5'-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTC-3',U6-R:5'-CCATCGGAAGCTCGTATACGA-3';p53-F:5'-TCAGCATCTTATCCGAGTGGAA-3',p53-R:5'-TGTAGTGGATGGTGGTACAGTCA-3',GAPDH-F:5'-CAAGTTCAACGGCACAG-3',GAPDH-R:5'-CCAGTAGACTCCACGACAT-3'。反应条件:95℃变性15s,60℃退火20s,70℃延伸60s，共36个循环。采用2-△△Ct法计算miR-22及p53mRNA相对表达量。

1.2.11Westernblot检测相关蛋白表达

提取梗死交界区心肌组织蛋白或外泌体蛋白，经过定量后取20μg蛋白样本进行电泳分离，转移蛋白至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2h。加入一抗CD63(稀释比1∶1000)、CD81(稀释比1∶2000)、p53(稀释比1∶1000)、Bcl-2(稀释比1∶1000)、Bax(稀释比1∶1000)、GAPDH及Cleaved-caspase-3(稀释比1∶1000),4℃孵育过夜，PBST清洗3次，加入二抗稀释液，室温孵育1h，再用PBST清洗3次。滴加化学发光试剂，于暗室中曝光，读取条带灰度值。

1.3统计学处理

采用SPSS22.0软件对数据进行比较分析，符合正态分布计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1BMSCs鉴定

流式细胞术检测BMSCs表面标志物显示，CD34阳性表达率为(1.47±0.25)%,CD44阳性表达率为(95.42±1.29)%,CD90阳性表达率为(93.54±1.33)%，见图1。茜素红染色结果显示，BMSCs经成骨诱导分化后可形成大量橘红色钙结节，说明成功分离获得BMSCs，见图2。

图2AMI大鼠BMSCs成骨诱导21d后茜素红染色观察(200×)

2.2外泌体鉴定

经透射电子显微镜扫描显示，可观察到直径50～100nm的囊泡(见图3A);WesternBlot结果显示，与细胞裂解液比较，所提取物质中外泌体特异性表达标志物CD63和CD81高表达，而细胞裂解液中未检测到CD63和CD81蛋白表达(见图3B)。表明成功分离获得BMSCs分泌的外泌体。

图3AMI大鼠外泌体形态观察及特异性蛋白CD63、CD81表达检测

图1流式检测AMI大鼠BMSCs表面标志物CD34、CD44和CD90的表达

2.3慢病毒转染后各组BMSCs及其外泌体中miR-22表达水平

经miR-22过表达慢病毒载体转染后，BMSCs/miR-22组及ExoBMSCs/miR-22组中miR-22表达水平明显升高(P<0.05，见图4A和4B)，表明转染实验成功，获得高表达miR-22的BMSCs及其外泌体。

图4qRT-PCR检测AMI大鼠BMSCs及外泌体中miR-22的表达

2.4miR-22过表达的BMSCs外泌体对AMI大鼠心脏功能及心肌梗死的影响

与Sham组比较，AMI模型组LVDd和LVDs值及心肌梗死面积均明显升高(P<0.05),LVEF及FS明显降低(P<0.05);与AMI组比较，经BMSCs来源外泌体干预后，各干预组大鼠LVDd和LVDs及心肌梗死面积均明显降低(P<0.05)，而LVEF及FS均明显升高(P<0.05);与ExoBMSCs/miR-NC组比较，ExoBMSCs/miR-22组效果改善更明显(P<0.05)。见表1。

表1各组AMI大鼠心脏功能及心肌梗死面积比较

2.5miR-22过表达的BMSCs外泌体对AMI大鼠心肌细胞凋亡的影响

与Sham组比较，AMI组心肌细胞凋亡率明显升高(P<0.05);经BMSCs外泌体干预后，心肌细胞凋亡率明显低于AMI组(P<0.05)，而与ExoBMSCs/miR-NC组比较，ExoBMSCs/miR-22组心肌细胞凋亡改善效果更明显(P<0.05)。见图5。

2.6miR-22过表达的BMSCs外泌体对AMI大鼠心肌组织中miR-22及p53mRNA表达的影响

与Sham组比较，AMI组心肌组织中miR-22表达明显降低(P<0.05)，而p53表达明显升高(P<0.05);与AMI组比较，各BMSCs来源外泌体干预组miR-22表达明显升高(P<0.05),p53表达明显降低(P<0.05);与ExoBMSCs/miR-NC组比较，ExoBMSCs/miR-22组miR-22表达上调、p53表达下调更明显(P<0.05)。见图6。

图5TUNEL染色观察AMI大鼠心肌细胞凋亡(40×)

图6AMI大鼠心肌组织中miR-22和p53mRNA水平比较

2.7miR-22过表达的BMSCs外泌体对AMI大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白表达的影响

与Sham组比较，AMI组心肌组织中Bcl-2表达明显降低(P<0.05),Bax、Cleaved-caspase-3及p53蛋白表达明显升高(P<0.05);与AMI组比较，各BMSCs来源外泌体干预组Bcl-2表达明显升高(P<0.05),Bax、Cleaved-caspase-3及p53蛋白表达明显降低(P<0.05);与ExoBMSCs/miR-NC组比较，ExoBMSCs/miR-22组Bcl-2表达进一步升高，Bax、Cleaved-caspase-3及p53表达进一步降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图7。

3、讨论

AMI伴随着心肌细胞的缺血缺氧、凋亡坏死以及炎症反应等病理过程，对心脏功能造成不可逆的损伤，导致临床上常规药物或手术的治疗效果并不理想。研究发现，干细胞移植，分化成心肌细胞可替代梗死心肌细胞，从而改善AMI心脏功能[13]。干细胞移植为AMI治疗策略的研究提供了新方向，而干细胞分泌的外泌体比干细胞本身具有更大的治疗价值[6,7]。外泌体是一种直径为30～100nm的双层脂质膜囊泡，携带有多种蛋白质、mRNA、miRNA等大分子物质，外泌体miRNA传递至靶细胞，可对受损的心肌细胞起到改善和修复心肌功能的作用[14]。外泌体miRNA在心肌梗死中可发挥抗凋亡、抗炎、抗心肌重构等作用，其中来源于MSC的外泌体中富含miR-22可起到抗细胞凋亡作用[15]。Li等[16]研究结果显示，miR-22可促进心肌细胞自噬和抑制凋亡，从而发挥保护心肌损伤的作用。因此，上调AMI大鼠心肌组织中miR-22的表达，通过其抑制心肌细胞凋亡作用可能对心肌缺血-再灌注损伤有所保护。本研究成功构建AMI大鼠模型，经BMSCs外泌体干预后，AMI大鼠心脏功能得到改善，心肌梗死面积减少，心肌细胞凋亡水平降低，而miR-22过表达外泌体组干预后的改善效果更明显，提示BMSCs来源外泌体移植治疗在AMI缺血-再灌注损伤中具有较好的治疗作用，且miR-22过表达修饰的外泌体比未经修饰的外泌体更好地改善心脏功能，抑制心肌细胞凋亡。

为了进一步探讨miR-22对AMI的保护作用机制，通过Targetscan网站预测发现miR-22与p53之间存在结合位点，p53是一种重要的抑癌基因，可在心肌细胞中表达，在心肌梗死、高血压及动脉粥样硬化等心血管疾病的发展过程中发挥重要作用[17]。当发生缺氧、缺血或缺血-再灌注损伤时，心肌细胞中p53基因的表达会明显增加，而p53信号通路激活可诱导心肌细胞凋亡[18,19]。本研究结果显示，miR-22过表达外泌体治疗AMI大鼠后，心肌组织中miR-22表达升高，而p53表达降低，提示miR-22可负调控p53，经miR-22过表达修饰的外泌体可能是通过下调AMI大鼠心肌组织中p53的表达，抑制心肌细胞的凋亡。

图7AMI大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase-3和p53蛋白表达水平比较

线粒体介导的内源性凋亡途径是细胞凋亡的主要机制之一，p53通过激活线粒体凋亡途径促进心肌细胞凋亡，还可导致线粒体功能障碍，促进心力衰竭发生[18]。Bcl-2家族在线粒体凋亡途径中发挥关键性作用，p53通过靶向调控Bcl-2家族蛋白的表达，降低线粒体膜电位，增加膜通透性，从而使线粒体内的细胞色素C被释放，触发Caspase-3凋亡反应，引起心肌细胞凋亡[20,21]。Sun等[22]实验结果也证实了p53通过介导Bcl-2相关线粒体凋亡途径调节心肌细胞凋亡，抑制p53可降低线粒体凋亡途径的激活，从而保护心肌细胞。本研究中各BMSCs来源外泌体干预组心肌组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，Bax和Cleaved-caspase-3表达下调，miR-22过表达外泌体组Bcl-2上调及Bax、Cleaved-caspase-3下调效果更明显，可能是因为miR-22抑制p53表达，影响了p53介导心肌细胞线粒体凋亡通路，这也解释了miR-22外泌体治疗后AMI大鼠心肌细胞凋亡率降低的现象。

综上所述，miR-22修饰的BMSCs外泌体作用于AMI大鼠，可改善大鼠心脏功能，减少心肌梗死面积，抑制心肌细胞凋亡，其作用机制可能与miR-22靶向抑制p53激活线粒体凋亡途径相关。

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