脓毒症是宿主对感染的异常反应引发的危重疾病,进展迅速且死亡率高,可导致多器官功能障碍,已成为公认的全球健康问题,且尚无特异性疗法｡脓毒症可引发肠道屏障损伤进而发生细菌易位,加剧全身炎症反应,并导致多器官功能障碍[1],因此关注肠道屏障损伤是治疗脓毒症的关键｡肠道屏障功能的完整性可以通过上皮紧密连接蛋白的表达来评估,Ras同源基因家族成员A(RashomologgenefamilymemberA,RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho-associatedcoiled-coilformingproteinkinase1,ROCK1)信号通路已被证明在调节肠道细胞间紧密连接中起关键作用[2],同时也被证实在脓毒症急性肺损伤等并发症中发挥着调控作用[3]｡马钱苷是一种具有强大药理作用的环烯醚萜类化合物,研究表明,通过其抗炎､抗凋亡作用可明显改善烧伤后引发的肠道屏障损伤和肠道功能障碍,发挥肠道保护作用[4]｡但马钱苷是否通过调节RhoA/ROCK1信号通路来改善脓毒症大鼠的肠道屏障损伤尚不可知｡本研究通过建立脓毒症大鼠模型,旨在探讨马钱苷对脓毒症大鼠炎症反应､肠道屏障损伤的影响及其潜在机制｡

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用主要仪器包括MultiskanMK3型酶标仪(美国ThermoScientific公司);DM4B型光学显微镜(德国Leica公司);EnduroGDS型凝胶成像系统(北京兰博康斯科技有限公司)｡

1.2主要药品与试剂

马钱苷对照品(纯度99.7%,批号yb-2148)购自成都普瑞法科技开发有限公司;RhoA激活剂溶血磷脂酸(lysophosphatidicacid,LPA;批号SAB2107510)购自美国Sigma公司;阿托伐他汀对照品(纯度98.0%,批号T3116)购自南京赛泓瑞生物科技有限公司;白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒(批号27193)购自深圳市科润达生物工程有限公司;内毒素试剂盒(批号SBJR0392)､山羊血清(批号SBJ012)均购自南京森贝伽生物科技有限公司;D-乳酸试剂盒､D-氨基酸氧化酶(Daminoacidoxidase,DAO)试剂盒､鼠源闭锁小带蛋白(zonulaoccludens-1,ZO-1)抗体､鼠源闭锁蛋白(Occlu‐din)抗体､鼠源RhoA抗体､鼠源ROCK1抗体(批号依次为ab197004､ab273325､ab307799､ab216327､ab187027､ab134181)均购自英国Abcam公司;IL-6试剂盒(批号QN-PS1726)购自上海岑特生物科技有限公司;肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)试剂盒(批号ER006)购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司｡

1.3实验动物

SPF级大鼠,雄性,体重(190±20)g,购自广州明迅生物科技有限责任公司,实验动物生产许可证号为SCXK(粤)2024-0070｡大鼠在无特异性病原体的标准环境中适应性喂养1周,自由摄食､饮水｡本研究通过河北中医药大学实验动物管理和伦理委员会批准(编号:DWLL202306019)｡

2、方法

2.1脓毒症大鼠模型的制备及干预

大鼠禁食8h后,按照随机数字表法分为造模组(n=50)及假手术组(n=10)｡造模组大鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉,采用盲肠结扎和穿刺法建立脓毒症模型[5]｡假手术组大鼠接受相同的手术,不包括盲肠结扎和穿刺｡术后监测大鼠平均动脉压,当平均动脉压下降30%,提示脓毒症大鼠模型构建成功｡将造模成功的大鼠随机分为脓毒症组､马钱苷低剂量组､马钱苷高剂量组､阳性对照组､马钱苷高剂量+LPA组,每组10只｡马钱苷低､高剂量组大鼠分别灌胃50､200mg/kg的马钱苷[6];阳性对照组大鼠腹腔注射0.2mg/kg的阿托伐他汀[7];马钱苷高剂量+LPA组大鼠灌胃200mg/kg的马钱苷,并腹腔注射10mg/kg的LPA[8];脓毒症组和假手术组大鼠灌胃与马钱苷等体积的生理盐水,每6h给药1次,连续给药4次｡

2.2血清炎症因子指标分析

末次给药24h后,麻醉并处死各组大鼠,从其心脏抽取血液,并以3000×g离心15min,取上清液,用酶联免疫吸附测定试剂盒测定IL-6､TNF-α､IL-1β水平｡

2.3回肠组织病理学变化观察

对各组大鼠血液收集完毕后,分离其回肠组织,取部分组织用4%多聚甲醛固定､石蜡包埋,制成切片(5μm),经脱蜡､脱水后,行苏木精和伊红染色,用光学显微镜观察回肠组织病理学变化,依据组织学损伤变化进行Chiu’s肠黏膜损伤评分[9]｡

2.4回肠组织中肠功能指标的检测

取“2.3”项下各组大鼠的回肠组织,以5000×g离心10min进行匀浆,取上清液,用酶联免疫吸附法检测肠道黏膜屏障功能指标DAO､D-乳酸及内毒素的水平｡

2.5回肠组织中ZO-1､Occludin的阳性表达检测

取“2.3”项下各组大鼠的回肠组织切片,常规脱蜡并用梯度乙醇水合,用抗原修复溶液,冷却后,滴加山羊血清封片,随后加入ZO-1､Occludin抗体(稀释比例分别为1∶1000､1∶2000),在4°C下孵育过夜;次日加入相应二抗(稀释比例为1∶5000),室温避光孵育2h后,以DAB显色､苏木精再染色､梯度乙醇脱水､二甲苯透明和中性树脂封片,用显微镜观察ZO-1､Occludin的阳性染色面积｡采用ImageJ软件计算阳性染色面积百分比｡

2.6回肠组织中RhoA､ROCK1的蛋白表达检测

取“2.3”项下各组大鼠的回肠组织,提取总蛋白,于98℃水浴中煮沸10min进行变性,经电泳分离并湿法转膜后加入脱脂牛奶,封闭过夜,次日加入RhoA､ROCK1､β-肌动蛋白(β-actin)抗体(稀释比例均为1∶1000),在4°C下孵育过夜;洗膜后,次日加入相应二抗(稀释比例为1∶200),室温孵育1.5h;使用SuperECL试剂盒呈色,采用凝胶成像系统和ImageJ软件分析,以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值表示目的蛋白的相对表达水平｡

2.7统计学分析

使用SPSS27.0软件分析数据｡符合正态分布的计量资料以x±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验｡检验水准α=0.05｡

3、结果

3.1马钱苷对大鼠血清中IL-6､TNF-α､IL-1β水平的影响

与假手术组比较,脓毒症组大鼠血清中IL-6､TNFα､IL-1β水平均显著升高(P<0.05);与脓毒症组比较,马钱苷低､高剂量组和阳性对照组大鼠血清中IL-6､TNF-α､IL-1β水平均显著降低(P<0.05),且马钱苷高剂量组显著低于马钱苷低剂量组(P<0.05);与马钱苷高剂量组比较,马钱苷高剂量+LPA组大鼠血清中IL-6､TNF-α､IL-1β水平均显著升高(P<0.05)｡结果见表1｡

表1各组大鼠血清中IL-6､TNF-α､IL-1β水平比较(x±s,n=10,pg/mL)

3.2马钱苷对大鼠回肠组织病理学的影响

假手术组大鼠回肠组织无坏死､水肿等现象,组织结构完整;脓毒症组大鼠回肠组织绒毛排列紊乱,黏膜下间质水肿及炎性浸润显著,组织破坏严重,Chiu’s肠黏膜损伤评分([5.17±0.53)分]较假手术组(0分)显著升高(P<0.05);与脓毒症组比较,马钱苷低､高剂量组和阳性对照组大鼠回肠组织的破坏程度得到缓解,组织水肿及炎性浸润均明显减轻,Chiu’s肠黏膜损伤评分[分别为(3.34±0.37)､(2.06±0.22)､(2.18±0.23)分]均显著降低(P<0.05);与马钱苷高剂量组比较,马钱苷高剂量+LPA组大鼠回肠组织损伤加重,Chiu’s肠黏膜损伤评分([3.42±0.36)分]显著升高(P<0.05)｡结果见图1｡

图1各组大鼠回肠组织病理学变化的显微图(苏木精和伊红染色)

3.3马钱苷对大鼠回肠组织中DAO､D-乳酸及内毒素水平的影响

与假手术组比较,脓毒症组大鼠回肠组织中DAO､D-乳酸及内毒素水平均显著升高(P<0.05);与脓毒症组比较,马钱苷低､高剂量组和阳性对照组大鼠回肠组织中DAO､D-乳酸及内毒素水平均显著降低,且马钱苷高剂量组显著低于马钱苷低剂量组(P<0.05);与马钱苷高剂量组比较,马钱苷高剂量+LPA组大鼠回肠组织中DAO､D-乳酸及内毒素水平均显著升高(P<0.05)｡结果见表2｡

表2各组大鼠回肠组织中DAO､D-乳酸及内毒素水平比较(x±s,n=10,pg/mL)

3.4马钱苷对大鼠回肠组织中ZO-1､Occludin阳性表达的影响

与假手术组比较,脓毒症组大鼠回肠组织中ZO-1､Occludin阳性染色面积百分比均显著降低(P<0.05);与脓毒症组比较,马钱苷低､高剂量组和阳性对照组大鼠回肠组织中ZO-1､Occludin阳性染色面积百分比均显著升高,且马钱苷高剂量组显著高于马钱苷低剂量组(P<0.05);与马钱苷高剂量组比较,马钱苷高剂量+LPA组大鼠回肠组织中ZO-1､Occludin阳性染色面积百分比均显著降低(P<0.05)｡结果见图2､图3､表3｡

图2各组大鼠回肠组织中ZO-1阳性表达的显微图

图3各组大鼠回肠组织中Occludin阳性表达的显微图

表3各组大鼠回肠组织中ZO-1､Occludin阳性染色面积百分比比较(x±s,n=10,%)

3.5马钱苷对大鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白表达的影响

与假手术组比较,脓毒症组大鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白的相对表达水平均显著升高(P<0.05);与脓毒症组比较,马钱苷低､高剂量组和阳性对照组大鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白的相对表达水平均显著降低,且马钱苷高剂量组显著低于马钱苷低剂量组(P<0.05);与马钱苷高剂量组比较,马钱苷高剂量+LPA组大

鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白的相对表达水平均显著升高(P<0.05)｡结果见图4､表4｡

图4各组大鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白表达的电泳图

表4各组大鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白的相对表达水平比较(x±s,n=10)

4、讨论

在脓毒症发生期间,机体炎症反应急剧增加,释放大量炎症因子,大量细菌和内毒素进入血液,加剧炎症反应并加速随后器官损伤的过程｡肠道是受脓毒症影响的第一个器官｡肠黏膜的完整性被破坏,会导致肠道屏障功能受损,引起宿主的过度炎症反应,诱发全身炎症反应综合征,而全身炎症反应综合征会再次损害肠道,两者互为因果､相互促进,最终造成脓毒症及多器官功能障碍[10―11]｡TNF-α在脓毒症的发病机制中起关键作用,IL-1β､IL-6则能启动脓毒症级联反应并反映炎症反应程度[12]｡本研究通过盲肠结扎和穿刺法建立脓毒症大鼠模型,结果显示,与假手术组比较,脓毒症组大鼠血清中IL-6､TNF-α､IL-1β水平均显著升高,回肠组织损伤严重,Chiu’s评分显著升高,表明炎症反应可引发肠黏膜的损害｡DAO是哺乳动物肠道黏膜中的一种高浓度酶,D-乳酸是肠道细菌的一种代谢产物,是肠道黏膜病变和屏障功能的敏感标志物[13]｡本研究结果显示,与假手术组比较,脓毒症组大鼠回肠组织中DAO､D-乳酸､内毒素水平均显著升高,提示脓毒症大鼠肠道屏障受损,此时迫切需要能调控该并发症的药物以改善疗效｡

马钱苷具有抗炎､抗氧化等活性,对某些炎症性疾病具有明显的治疗作用,如结肠炎､严重烧伤引发的肠道损伤等[4]｡本研究结果显示,马钱苷能显著改善大鼠的炎症反应､肠道指标及组织损伤,与阳性对照药阿托伐他汀的改善效果无明显差异｡这提示马钱苷可能对脓毒症引发的肠道损伤具有改善作用｡

细胞间紧密连接对维持和调节肠道屏障功能具有重要性｡Occludin､ZO-1是肠黏膜中紧密连接蛋白的成员,Occludin影响细胞间物质的通透性,ZO-1可结合多种细胞骨架蛋白,二者在维持肠黏膜屏障功能方面至关重要[14]｡RhoA是Rho家族蛋白的一员,是细胞信号转导的转导分子之一,而ROCK1是RhoA的主要下游信号分子｡Rho/ROCK1信号通路会影响细胞骨架及其紧密连接,进而改变肠黏膜屏障的通透性,在维持肠黏膜屏障完整性中发挥重要作用[15]｡本研究结果显示,与假手术组比较,脓毒症组大鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白的相对表达水平均显著升高,ZO-1､Occludin阳性染色面积百分比均显著降低,提示激活RhoA/ROCK1信号通路可能影响脓毒症大鼠的肠道屏障功能;但经马钱苷干预后,大鼠回肠组织中RhoA､ROCK1蛋白的相对表达水平均显著降低,ZO-1､Occludin阳性染色面积百分比均显著升高,推断马钱苷对脓毒症引发的肠道损伤具有改善作用,这可能与抑制RhoA/ROCK1信号通路有关｡为了验证上述推断,本研究还将RhoA激活剂LPA纳入实验,设置了马钱苷高剂量+LPA组,结果显示,LPA可显著逆转高剂量马钱苷对脓毒症致肠道损伤的改善作用,提示马钱苷可通过降低RhoA/ROCK1信号通路的活性来减轻脓毒症大鼠肠道屏障损伤及炎症反应｡

综上所述,马钱苷可减轻脓毒症大鼠炎症反应和肠道屏障损伤,其机制与抑制RhoA/ROCK1信号通路有关｡但由于脓毒症并发肠道屏障损伤的发病机制复杂,具有多方面的发病机制及通路,因此后续实验将针对其他机制进行进一步的研究｡

参考文献:

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基金资助:河北省中医药类科研计划课题(No.2022065,No.2020103);

文章来源:王灿,李岩涛,周正,等.马钱苷对脓毒症大鼠炎症反应及肠道屏障损伤的影响[J].中国药房,2025,36(05):574-578.