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润燥止痒胶囊对湿疹大鼠肠道菌群及短链脂肪酸的影响

2024-10-15 106 上传者：管理员

摘要：目的研究润燥止痒胶囊（RZZY）对湿疹大鼠肠道菌群及其代谢物短链脂肪酸（SCFA）的影响，以揭示RZZY对湿疹的改善作用及可能机制。方法将大鼠分为正常组、模型组、地氯雷他定组（1.5 mg/kg）和RZZY低、高剂量组（0.6、1.2 g/kg）。除正常组外，其余各组大鼠采用2,4-二硝基氯苯溶液涂抹脱毛区域致敏以构建湿疹模型，并灌胃相应药物，每天1次，连续2周。给药完成后，检测大鼠皮肤厚度，并进行湿疹面积及严重度指数（EASI）评分和病理评分；基于16S rDNA测序分析大鼠肠道菌群结构；采用气相色谱-质谱联用仪检测大鼠粪便中SCFA（乙酸、丙酸和丁酸）含量；检测大鼠结肠和皮肤组织中信号转导及转录激活因子3(STAT3)的表达水平。结果 RZZY可明显减轻湿疹大鼠皮肤红肿、溃烂症状，显著减小/降低大鼠EASI、皮肤厚度、病理评分（P<0.05）；显著升高湿疹大鼠肠道菌群ACE、Sobs和Shannon指数（P<0.05），促进大鼠肠道菌群向正常结构回调；提高湿疹大鼠肠道厚壁菌门和毛螺菌属、乳杆菌属、另枝菌属丰度，降低拟杆菌门/属丰度；显著升高湿疹大鼠粪便中丙酸、丁酸含量（P<0.05）；显著下调结肠和皮肤组织中STAT3蛋白表达（P<0.05）。结论 RZZY可通过调节肠道菌群提高SCFA水平来抑制STAT3表达，从而发挥抗炎作用，进而改善湿疹大鼠的皮肤炎症。

关键词：
RZZY
润燥止痒胶囊
湿疹
短链脂肪酸
肠道菌群
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润燥止痒胶囊（Runzao zhiyang capsule,RZZY）具有养血滋阴、祛风止痒、润肠通便的功效，是治疗皮肤病常用药物，对慢性湿疹等皮肤瘙痒症有良好治疗效果[1—2]，但具体作用机制尚不清楚。近年来研究发现，湿疹与肠道菌群失调相关[3]，如特应性湿疹婴儿的肠道富集大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，且粪便相关毒力因子基因表达增强[4]；短链脂肪酸（short-chain fatty acid,SCFA）作为肠道菌群的重要代谢物[5]，在湿疹患者体内含量显著降低[6]，可见肠道菌群失调是湿疹发生发展的重要环节。信号转导及转录激活因子3(signal transduction and acti‐vator of transcription 3,STAT3）是湿疹致病信号通路Janus激酶（Janus kinase,JAK）/STAT中的关键靶点[7]，且STAT3的激活与肠道菌群失调相关[8]，这提示调整肠道菌群可能有助于下调STAT3表达，从而改善湿疹症状。基于此，本研究拟构建湿疹大鼠模型，采用16S r DNA测序探讨RZZY对大鼠肠道菌群及SCFA的影响，并基于湿疹靶点STAT3初步研究RZZY的作用机制，以期为该药的临床应用提供实验依据。

1、材料

1.1主要仪器

本研究所用主要仪器有TRACE1300-ISQ型气相色谱-质谱联用仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Leica RM2125 RTS型石蜡切片机（上海徕卡仪器有限公司）、HC-3018R型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）、BP211D型十万分之一天平（德国Sarto‐rius公司）等。

1.2主要药品与试剂

RZZY（批号210601，规格0.5g/粒）购自国药集团同济堂（贵州）制药有限公司；地氯雷他定片（批号B220822，规格5 mg/片）购自深圳信立泰药业股份有限公司；兔源STAT3抗体（批号S28221020703）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（批号AC2407181）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；2-乙基丁酸（批号2630538）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；2,4-二硝基氯苯（2,4-dinitrochlorobenzene,DNCB）、丙酮均购自上海吉至生化科技有限公司。

1.3实验动物

本研究所用动物为SPF级SD大鼠，体重（200±20) g，购自南方医科大学实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（粤）2021-0041。大鼠饲养于温度为25℃的标准笼中，循环照明12 h，自由饮水摄食。本实验经南方医科大学实验动物伦理委员会审查批准（决议编号为L2021189）。

2、方法

2.1分组、造模与给药

取30只SD大鼠随机分为正常组（NC组）、模型组（MC组）、地氯雷他定组（DEXA组，阳性对照，1.5 mg/kg，剂量根据临床等效剂量换算而得）和RZZY低剂量组（RZZY-L组，0.6 g/kg，剂量根据临床等效剂量换算而得）、高剂量组（RZZY-H组，1.2 g/kg），每组6只。各组大鼠选取背部2 cm×2 cm皮肤脱毛后，NC组涂抹基质溶液（将丙酮和橄榄油按体积比4∶1配制而成），其余组在第1、2、3天用200µL 1%DNCB溶液（用基质溶液配制）涂抹致敏，每天1次。第4天DEXA组、RZZY-L组和RZZY-H组大鼠开始灌胃给药，MC组和NC组大鼠灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续2周（即给药至第18天）。其间，在第7、10、13、16天加用100µL 0.5%DNCB溶液涂抹脱毛区皮肤，促进造模，当皮肤出现红斑、水肿等症状时，提示湿疹模型构建成功[1,9]。

2.2样品收集

给药完成后，参考湿疹面积及严重度指数（eczema area and severity index,EASI）评分法[10―11]，对干预前后的皮肤厚度和症状进行评价。收集各组大鼠粪便进行肠道菌群及其代谢物SCFA分析，然后处死大鼠收集结肠和皮肤组织，取一部分进行苏木精-伊红（HE）染色，以观察皮肤病理学形态变化并进行评分[9]。

2.3大鼠肠道菌群组成分析

鉴于高剂量的RZZY对湿疹具有良好药效，因此笔者进一步通过肠道菌群探讨其改善湿疹的作用机制。采用338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物提取大鼠粪便样本总DNA，然后提取、纯化和定量扩增子。使用Illumina Mi Seq2500测序平台进行测序反应，在97%截断点处将干净序列划分为多个操作分类单位（opera‐tional taxonomic units,OTUs），用于生物信息学分析，通过韦恩图、ACE指数、Sobs指数和Shannon指数进行肠道菌群α多样性分析，通过主成分分析（principal compo‐nent analysis,PCA）和主坐标分析（principal co-ordinates analysis,PCo A）进行肠道菌群β多样性分析，同时对肠道菌群门属水平进行分析。

2.4大鼠粪便中SCFA含量测定

精密称取各组大鼠粪便样品1 g，加入1 m L水混匀，常温超声10 min，然后于4℃下以15 000 r/min离心10min；取1 m L上清液，加入100μg/m L 2-乙基丁酸甲醇溶液（内标）10μL、50%硫酸溶液10μL、无水硫酸钠0.5 g、乙醚2 m L，于4℃下以5 000 r/min离心10 min。取适量上清液，采用气相色谱-质谱联用仪检测样品中乙酸、丙酸和丁酸的含量[12―13]，具体分析条件如下：色谱柱为DB-FFAP122-3232型气相毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），载气为氮气，流速为1.2 m L/min，进样量为1μL；升温程序从80℃开始，保留1 min后以10℃/min升至170℃，再以20℃/min升至200℃并保留2 min；检测器和进样口温度分别为230、200℃，氢气、空气、氮气流速分别为30、300、30 m L/min。

2.5大鼠结肠、皮肤组织中STAT3蛋白表达水平检测

取剩余的结肠、皮肤组织适量，用4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片。将石蜡切片置于68℃烤箱中烘烤20 min，用二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水，然后置于3%H2O2溶液中于37℃条件下孵育10 min以修复抗原；加入STAT3一抗（稀释度为1∶100），于4℃条件下孵育12h，再加入相应二抗（稀释度为1∶2 000），于37℃条件下孵育30 min；用水充分洗涤后，进行苏木精复染、常规脱水、封片；采用ImageJ软件分析STAT3蛋白阳性表达区域（棕色）的平均光密度，以评价该蛋白的表达水平。

2.6统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，对EASI、皮肤厚度等正态分布数据（以表示）采用单因素方差分析；对16S r DNA测序中PCA和PCo A分析等非正态分布数据采用非参数多元方差分析进行组间差异比较。检验水准α=0.05。

3、结果

3.1 RZZY对湿疹大鼠皮肤病理状态的影响

给药完成后，NC组大鼠脱毛区皮肤未出现红斑、红肿，且无炎症细胞浸润。与NC组比较，MC组大鼠脱毛区皮肤出现严重的红斑、红肿、溃烂现象，存在大量炎症细胞浸润，且EASI、皮肤厚度、病理评分均显著升高/增加（P<0.05）。与MC组比较，各给药组大鼠上述病理状态明显减轻，皮肤损伤得到不同程度修复，上述EASI、皮肤厚度、病理评分均显著降低/减小（P<0.05）。结果见表1、图1。

表1 各组大鼠EASI、皮肤厚度、病理评分的比较,n=6)

3.2 RZZY对湿疹大鼠肠道菌群的影响

由韦恩图（图2）可知，RZZY-H组与NC组大鼠相同的肠道菌群数量多于MC组与NC组相同者，表明给药后肠道菌群物种向正常结构回调。

α多样性分析结果（图3）显示，与NC组比较，MC组大鼠肠道菌群ACE、Sobs和Shannon指数均显著降低（P<0.05）；与MC组比较，RZZY-H组大鼠上述指数均显著升高（P<0.05），这表明RZZY可改善湿疹大鼠肠道菌群丰度。

图1 各组大鼠皮肤外观和病理学形态观察结果

图3 肠道菌群α多样性分析结果

PCA和PCo A结果（图4）均显示，NC组与MC组大鼠肠道菌群距离较远，RZZY-H组大鼠肠道菌群向NC组方向靠近，这表明RZZY可改善湿疹大鼠肠道菌群结构。

图4 肠道菌群β多样性的PCA和PCoA结果

门水平分析（图5A）结果显示，RZZY可提高肠道厚壁菌门Firmicutes的丰度，降低拟杆菌门Bacteroidetes的丰度。属水平分析（图5B）结果显示，RZZY可提高毛螺菌属Lachnospiraceae＿NK4A136＿group、乳杆菌属Lacto‐bacillus和另枝菌属Alistipes的丰度，降低拟杆菌属Bac‐teroides的丰度。

图5 肠道菌群门属水平分析结果

3.3 RZZY对湿疹大鼠粪便中SCFA含量的影响

与NC组比较，MC组大鼠粪便中丙酸、丁酸含量均显著降低（P<0.05）；乙酸含量也有所降低，但差异无统计学意义。与MC组比较，RZZY-H组大鼠粪便中丙酸、丁酸含量均显著升高（P<0.05）；乙酸含量也有所升高，但差异无统计学意义。结果见表2。

表2 各组大鼠粪便中乙酸、丙酸和丁酸含量的比较n=6,mmol/g)

3.4 RZZY对湿疹大鼠皮肤和结肠组织中STAT3蛋白表达的影响

与NC组比较，MC组大鼠皮肤和结肠组织中STAT3蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。与MC组比较，RZZY-H组大鼠皮肤和结肠组织中STAT3蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）。结果见图6、表3。

4、讨论

RZZY在临床上主要用于治疗阴虚血燥证所致的皮肤病患。本研究通过构建湿疹大鼠模型后发现，RZZY可明显减轻模型大鼠皮肤肿胀和溃疡症状，对湿疹具有良好的改善效果。研究发现，皮肤病与肠道菌群存在关联，如银屑病血燥证患者的肠道菌群较健康人群发生了紊乱[14]，特应性湿疹婴儿发生肠道菌群失调[4]等。本研究也发现，湿疹大鼠的肠道菌群与正常大鼠存在差异，经RZZY干预后，其肠道菌群明显回调；进一步进行的门水平和属水平分析发现，RZZY可提高厚壁菌门丰度，上调乳杆菌属、毛螺菌属和另枝菌属的丰度，其中乳杆菌属和毛螺菌属是具有抗炎、调节肠黏膜免疫的常见益生菌[15]。这提示RZZY可能通过上调益生菌的丰度而发挥改善湿疹的作用。

图6 各组大鼠皮肤和结肠组织中STAT3蛋白表达的免疫组化图

表3 各组大鼠皮肤和结肠组织中STAT3蛋白表达水平的比较n=6)

SCFA是厌氧菌通过发酵将单糖降解的磷酸烯醇丙酮酸转化而来，主要成分有乙酸、丙酸和丁酸等，当肠道菌群失调时，其水平显著降低[13]。本研究结果显示，经RZZY干预后，大鼠粪便中丙酸和丁酸含量显著升高。研究发现，乳杆菌属和毛螺菌属均具有抗炎和产生SCFA的作用[15]。RZZY方中何首乌、地黄等药材具有上调乳杆菌属和毛螺菌属等SCFA生产菌的功能，其中地黄主要活性成分水苏糖可作为乳杆菌属的主要碳源，通过上调细菌磷酸转移酶、能量耦合因子转运蛋白等的表达水平，促进细菌生长[16―17]。这表明RZZY改善湿疹的作用可能与调节肠道菌群促进SCFA产生相关。

JAK/STAT信号通路是湿疹治疗的重要途径[7]，其中STAT3是该信号通路的关键靶点：抑制STAT3活性，可降低Th17细胞分化活性，从而减轻湿疹引起的皮肤炎症[18]。本研究结果显示，RZZY能够显著下调湿疹大鼠皮肤组织和结肠组织中STAT3的表达。研究发现，丁酸可与STAT3结合，从而抑制STAT3信号通路活性，进而发挥抗炎作用[19]。此外，SCFA可被吸收入血[12]，这也提示SCFA可能通过循环系统到达皮肤病灶部位发挥对STAT3的调控作用，从而协同减轻皮肤炎症。

综上所述，RZZY可通过调节肠道菌群提高SCFA水平来抑制STAT3表达，从而发挥抗炎作用，进而改善湿疹大鼠的皮肤炎症。

参考文献:

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基金资助:广东省基础与应用基础研究基金项目(No.2019A1515110600);

文章来源:胡银霞,陈梓钊,刘昌顺,等.润燥止痒胶囊对湿疹大鼠肠道菌群及短链脂肪酸的影响[J].中国药房,2024,35(19):2372-2377.