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特应性皮炎小鼠皮损中丝聚蛋白和胸腺基质淋巴生成素表达受窄谱中波紫外线照射影响和可通信机制

2020-06-28 428 上传者：管理员

摘要：目的检测窄谱中波紫外线(narrow-band ultraviolet B, NB-UVB)照射对特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)小鼠皮损中丝聚蛋白(filaggrin, FLG)和胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)表达的影响,探讨其治疗AD的可能机制。方法 16只C57BL/6J小鼠分为照光组和非照光组,每组8只,于实验第1～9天,每日将钙泊三醇(2 nmol/L)局部外用于2组小鼠背部制备AD小鼠模型,模型制备同时照光组采用NB-UVB照射,隔日1次。观察2组小鼠皮损临床表现及第2、4、6、8天皮损严重程度评分和病理学表现;采用实时荧光定量PCR法检测AD小鼠皮损中FLG、TSLP mRNA相对表达量及AD小鼠皮损引流淋巴结中白细胞介素(interleukin, IL)-4、IL-13、协同刺激分子配体(OX40-ligand, OX40L)、TSLP受体(thymic stromal lymphopoietin receptor, TSLPR)mRNA相对表达量。结果照光组小鼠第2、4、6、8天皮损严重程度评分[(0.670±0.516)、(1.330±0.516)、(1.670±0.516)、(2.170±0.408)分]均低于非照光组[(1.500±0.548)、(2.160±0.408)、(2.500±0.548)、(2.830±0.408)分](P<0.05),且皮损组织海绵水肿、淋巴细胞浸润等炎症表现较非照光组轻。照光组皮损组织TSLP mRNA相对表达量(0.417±0.040)低于非照光组(1.000±0.092)(P<0.05),FLG mRNA相对表达量(1.860±1.187)高于非照光组(1.000±0.523)(P<0.05);照光组皮损引流淋巴结中IL-13 mRNA(0.528±0.160)、OX40L mRNA(0.634±0.178)及TSLPR mRNA(0.669±0.075)相对表达量均低于非照光组(1.000±0.404、1.000±0.312、1.000±0.241)(P<0.05),IL-4 mRNA相对表达量(0.909±0.180)与非照光组(1.000±0.205)比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NB-UVB照射可能通过上调AD小鼠皮损中屏障蛋白FLG表达,下调TSLP表达,并降低IL-13、OX40L及TSLPR等相关炎性因子表达,从而发挥治疗AD的作用。

关键词：
丝聚蛋白
小鼠
特应性皮炎
窄谱中波紫外线
胸腺基质淋巴生成素
角质形成细胞
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特应性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病,患者常伴有变应性鼻炎或变应性哮喘等疾病[1]。AD病因复杂,目前认为是遗传和环境相关因素作用下,患者出现皮肤屏障功能障碍和免疫调节异常[2],其中皮肤屏障功能损伤是AD发病的第一步。角质形成细胞所形成的“砖墙结构”具有物理屏障作用,其所含结构成分丝聚蛋白(filaggrin, FLG)及其代谢产物是重要的屏障蛋白,对维持皮肤屏障功能有重要作用[3]。AD患者皮损中胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)表达明显增加[4]。TSLP是一种角质形成细胞分泌的促炎因子,可导致白细胞介素(interleukin, IL)-4、-13等炎性因子表达增加,进一步反馈性下调角质形成细胞中FLG的表达,导致表皮屏障功能持续损伤。窄谱中波紫外线(narrow-band ultraviolet B, NB-UVB)(波长为311～312 nm)照射是治疗AD的常用方法[5],但目前NB-UVB治疗AD的具体作用机制尚不明确。本研究以钙泊三醇诱导的AD小鼠为研究对象,探讨NB-UVB照射对AD的治疗作用以及对皮损中FLG、TSLP和皮损引流淋巴结中IL-4、IL-13、协同刺激分子配体(OX40-ligand, OX40L)及TSLP受体(TSLP receptor, TSLPR)表达的影响,并探讨可能的作用机制,报道如下。

1、材料与方法

1.1一般材料

C57BL/6J小鼠16只,6～8周龄,体质量约25 g,购自南京模式动物研究所,动物合格证号为SCXK(苏)2018-0008。小鼠自由进食、饮水,饲养于深圳北京大学香港科技大学医学中心实验动物中心SPF级动物房[地点使用许可证号SYXK(粤)2015-0106],饲养环境温度21～25℃,湿度为60%～65%,保持12 h昼夜节律。本研究经北京大学深圳医院医学伦理委员会审核批准。

1.2方法

1.2.1主要仪器与试剂

钙泊三醇、Trizol试剂(美国Sigma),SH4B型紫外线光疗仪(波长为311 nm,上海希格玛,注册证号:沪械注准20172260223),照射剂量采用以下公式计算:辐照剂量(mJ/cm2)=辐照强度(mW/cm2)×辐照时间(s),照射剂量为中剂量(60 mJ/cm2)。实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad CFX96),紫外线分光光度仪(Thermo Nanodrop),反转录试剂盒(Takara® PrimeScript),实时荧光定量PCR试剂盒(Bio-Rad SYBR® Green Supermix),引物合成及测序(深圳华大基因科技服务有限公司)。

1.2.2 AD小鼠模型制备与分组

应用钙泊三醇诱导AD小鼠模型,制备方法参考文献[6]。将钙泊三醇溶于无水乙醇中配制成2 nmol/L溶液,—20℃保存。实验前根据C57BL/6J小鼠性别配对并随机分为照光组和非照光组,每组8只。体积分数2.5%乙醚吸入麻醉小鼠,并将小鼠背部正中毛发剔除1 cm×1 cm,于实验第1～9天(共9次),2组每天均用25μL钙泊三醇均匀涂抹小鼠裸皮肤1次,诱导AD样皮损;照光组在第1、3、5、7、9天分别加行NB-UVB 60 mJ/cm2定量照射治疗,操作结束后将小鼠放回饲养区。小鼠背部皮肤出现明显红斑、鳞屑及结痂为造模成功。动物模型制备的第2、4、6、8天对AD小鼠皮损(红斑、鳞屑和结痂)严重程度进行评分[7]:0分为正常、1分为轻度、2分为中度、3分为重度。

1.2.3标本采集

于实验第10天处死小鼠,分别收取2组实验区域及非照光组非实验区域皮肤、腹股沟部位皮损引流淋巴结组织样本。小鼠实验区域皮肤取下后,从中间分为2份,1份剪碎匀浆后置于1.5 mL离心管中加入1 mL Trizol冻存,另1份展平放入体积分数10%甲醛溶液固定待制作皮肤组织病理切片使用,非实验区域皮肤也置于体积分数10%甲醛溶液固定。淋巴结组织样本碾碎匀浆置于1.5 mL离心管中加入1 mL Trizol冻存待提取RNA用。

1.2.4实时荧光定量PCR法测定2组小鼠FLG、TSLP及其受体TSLPR、IL-4、IL-13和OX40L mRNA相对表达量

采用实时荧光定量PCR法检测FLG、TSLP及其受体TSLPR、IL-4、IL-13和OX40L mRNA相对表达量。根据关键词在引物数据库Primerbank中检索已被验证的结果,并进行BLAST确认引物序列,实验中目的基因的PCR引物序列见表1。采用Trizol一步法提取小鼠皮损总RNA,测定RNA浓度。用反转录试剂盒,将总RNA反转录为cDNA。以β-actin为内参,PCR反应体系:共20μL,包括cDNA模板6μL,ddH2O 2μL,上游引物2μL,下游引物2μL,SYBR Green Supermix 8μL。反应条件:95℃5 min;95℃10 s,共40个循环;58℃20 s,共40个循环;72℃20 s,共40个循环;65℃5 min。采用2—ΔΔCt值表示mRNA相对表达量。

表1目的基因的PCR引物序列

1.2.5 2组小鼠皮损组织病理学检查

采用HE染色。2组小鼠皮肤标本用体积分数10%甲醛溶液固定24 h,将组织块尽量展平,不规则的边缘修剪整齐,使其切面平整,能与刀面平行。脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色、封片,显微镜下观察,进行皮肤组织病理分析,记录拍照保存。

1.3统计学处理

应用GraphPad Prism 7软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,2组比较采用独立样本t检验;检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 2组AD小鼠皮损改变情况比较

非照光组小鼠在实验第2天背部即出现红斑反应,第6天可见红斑、鳞屑及结痂,并在实验中持续存在;照光组小鼠在实验2天出现轻度红斑,第8天可见明显红斑、鳞屑及结痂,提示造模成功。照光组实验第2、4、6、8天皮损严重程度评分均低于非照光组(P<0.05)。小鼠皮损部位皮肤组织病理学检查显示,与非实验部位皮肤相比,2组皮损部位表皮均有海绵水肿、真皮炎症浸润,提示造模成功,但照光组表皮海绵水肿和真皮炎症浸润表现较非照光组明显减轻。见表2及图1。

表2 2组AD小鼠皮损严重程度评分比较(x¯±s,分)

图1 2组AD小鼠皮损处组织病理图(HE，×100)

2.2 2组皮损组织TSLP、FLG mRNA相对表达量比较

照光组皮损组织TSLP mRNA相对表达量低于非照光组(P<0.05),FLG mRNA相对表达量高于非照光组(P<0.05)。见表3。

表3 2组皮损组织TSLP、FLG mRNA相对表达量比较(x¯±s)

2.3 2组皮损引流淋巴结中IL-4、IL-13、OX40L及TSLPR mRNA相对表达量比较

照光组皮损引流淋巴结中IL-13、OX40L、TSLPR mRNA相对表达量均低于非照光组(P<0.05),IL-4 mRNA相对表达量与非照光组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 2组皮损引流淋巴结中IL-4、IL-13、OX40L、TSLPR mRNA相对表达量比较(x¯±s)

3、讨论

AD是一种慢性复发性炎症性疾病,多伴随皮肤屏障功能受损和异常活化的炎性反应。角质形成细胞所含FLG及其降解产物对维持皮肤水合作用和屏障功能有重要作用,FLG缺乏可引起皮肤经皮水分丢失增加和皮肤干燥,可导致过敏原渗透性增加,诱发炎性反应[8]。与健康对照组比较,AD组患儿皮肤屏障功能存在明显障碍[9]。TSLP在AD皮损中大量表达,可与表皮中树突状细胞表面的受体TSLPR结合后刺激表皮中树突状细胞活化,在X40L辅助下,TSLP/OX40L通路促进初始T细胞分化为Th2细胞,进而影响IL-4和IL-13等细胞因子的产生,从而导致炎症的发生。因此,TSLP是将AD中固有免疫反应与获得性免疫反应关联的关键因素。此外,有研究[10]发现AD患者外周血中组胺H4受体表达升高,说明组胺H4受体可能也参与了AD的致病过程。

皮肤屏障功能障碍可能是AD发病的基础,而TSLP过表达是触发AD进展的关键因素,防止AD皮肤屏障损伤或促进屏障功能恢复,并抑制TSLP是AD治疗的关键。NB-UVB治疗AD安全、有效,但目前关于NB-UVB对AD治疗机制的研究仍较少,有研究[11]认为紫外线发挥治疗作用的主要机制是诱导活化T细胞凋亡进而抑制免疫反应。NB-UVB治疗的AD患者外周血CLA+CD8+ T细胞比率降低[12]。NB-UVB治疗后,AD患者外周血Th17细胞比率降低,Treg细胞比率增高,推测NB-UVB可能通过调节Th17/Treg细胞免疫失平衡而发挥治疗作用[13]。

三维人皮肤模型研究[14]发现,NB-UVB(100 mJ/cm2)照射后其表皮FLG表达增高。本研究结果显示,照光组小鼠皮损中FLG mRNA相对表达量明显高于非照光组,说明NB-UVB照射可上调屏障蛋白FLG表达。研究[15]发现NB-UVB和311 nm波长蓝宝石激光照射的AD小鼠皮损组织中TSLP表达均较对照组下降。有研究[16]应用308 nm准分子激光照射AD小鼠,结果发现AD小鼠皮损中TSLP较正常小鼠表达明显升高,但经308 nm准分子激光照射治疗后,AD小鼠皮损好转,且TSLP表达较未照光AD小鼠明显下降。本研究结果显示,照光组皮损组织TSLP mRNA相对表达量较非照光组明显下降,与上述应用AD小鼠模型进行光疗的研究结果[15,16]一致,说明NB-UVB照射可下调AD小鼠皮损中TSLP表达。本研究结果显示,照光组小鼠皮损引流淋巴结中IL-13、OX40L mRNA相对表达量均较非照光组下降,说明NB-UVB照射可能通过抑制OX40L降低了炎性因子的产生。本课题组前期研究[17]发现,NB-UVB可下调体外培养的表皮中树突状细胞中TSLPR表达而抑制T细胞活化;本研究结果显示,照光组皮损引流淋巴结中TSLPR mRNA相对表达量较非照光组明显降低,与前期研究结果[17]一致。

本研究结果提示,NB-UVB照射可能是通过直接增加屏障蛋白FLG表达而促进皮肤屏障功能恢复,通过抑制TSLP(TSLPR)/OX40L通路而抑制辅助性T细胞向Th2细胞活化,进而抑制下游炎性因子IL-13等表达,减轻炎性反应,从而起治疗AD的作用。

参考文献:

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黄海艳,李子卓,刘小明,杨婷,张考苑,张杰,窦侠.窄谱中波紫外线照射对特应性皮炎小鼠皮损中丝聚蛋白和胸腺基质淋巴生成素表达的影响及可能机制[J].中华实用诊断与治疗杂志,2020,34(06):541-544.