首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 外科论文 > 神经外科论文 > 青蒿琥酯调节Notch信号通路对脑缺血再灌注小鼠神经元损伤的影响

青蒿琥酯调节Notch信号通路对脑缺血再灌注小鼠神经元损伤的影响

2024-11-25 41 上传者：管理员

摘要：目的探究青蒿琥酯调节Notch信号通路对脑缺血再灌注(CIRI)小鼠神经元损伤的影响。方法 75只C57小鼠随机分为假手术(Sham)组、CIRI模型(CIRI)组，青蒿琥酯组、Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组，每组各15只。采用线栓法制备脑缺血2 h、再灌注24 h的CIRI小鼠模型。Longa法评估神经行为学评分；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测脑梗死体积；尼氏染色、TUNEL染色检测神经元损伤情况；免疫荧光染色检测脑组织中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性表达情况；酶联免疫吸附试验(ELISA)检测脑组织中炎性因子白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6水平；Western印迹检测脑组织中Notch信号通路相关蛋白Notch1,Jagged1,Notch受体胞内结构域(NICD),核因子(NF)-κB表达情况。结果与Sham组比较，CIRI组神经行为学评分、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、GFAP阳性表达和IL-1β、TNF-α、IL-6水平及Notch1、Jagged1、NICD、NF-κB蛋白表达均明显升高，尼氏体数量明显减少(P<0.05);与CIRI组比较，青蒿琥酯组神经行为学评分、脑梗死体积百分比、神经元凋亡率、GFAP阳性表达和IL-1β、TNF-α、IL-6水平及Notch1、Jagged1、NICD、NF-κB蛋白表达均明显降低，尼氏体数量明显增加，Notch激动剂组上述指标变化与之明显相反(P<0.05);与青蒿琥酯组比较，Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组上述指标除尼氏体数量明显减少外，其余指标均明显升高(P<0.05)。结论青蒿琥酯能够抑制CIRI小鼠脑组织炎症反应，减轻其神经元损伤，可能通过抑制Notch信号通路而实现。

关键词：
Notch信号通路
炎症
神经元
脑缺血再灌注
青蒿琥酯
加入收藏

缺血性脑卒中为脑卒中的常见类型，约占脑卒中患病人数的80%[1]。采用静脉溶栓或机械取栓以尽早恢复血供为治疗缺血性脑卒中最有效的手段，但血供恢复后一定时间内脑组织功能不但未能恢复，反而损伤加重，该现象被称为脑缺血再灌注损伤(CIRI),CIRI已成为脑卒中患者日益严峻的挑战[2]。近年来，越来越多的研究显示，炎症刺激在CIRI的发病机制中起重要作用，抗炎可能是防治CIRI的一种潜在策略[3]。

Notch是一种进化保守的信号通路，参与细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学过程。此外，Notch通路能够激活核因子(NF)-κB,使促炎因子释放，诱发炎症反应，越来越多的研究认为抑制Notch信号通路是防治CIRI的重要靶向策略[4,5]。青蒿琥酯是黄花蒿中提取的主要活性成分，不仅广泛用作抗疟疾药物，且具有显著的抗炎效果，对皮炎、关节炎、过敏性哮喘等疾病有积极作用[6～8]。目前已有少量研究报道青蒿琥酯对CIRI亦有一定的保护作用，但其作用机制仍需进一步探究[9,10]。有报道称，青蒿琥酯可通过抑制Notch信号通路抗肺纤维化[11]。本研究探讨青蒿琥酯调节Notch信号通路对CIRI小鼠神经元损伤的影响。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级C57小鼠，8 w,雄性，体质量22～24 g,购自北京华阜康生物公司(许可证号：SYXK(京)2019-0022)。喂养环境：光/暗各12 h交替模式，温度22～26℃,湿度40%～55%。

1.2主要试剂

青蒿琥酯(北京沃凯生物科技公司);Notch激动剂组Jagged1(MedChemExpress公司);2% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染液、1%甲苯胺蓝染液(均上海联硕生物科技公司);TUNEL染色试剂盒(上海联迈生物工程公司);白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(均上海酶联生物科技公司);放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、兔源一抗GAPDH、辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔二抗(均Absin公司);兔源一抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Jagged1及Alexa Fluor® 555标记的山羊抗兔二抗(均Abcam公司);兔源一抗Notch1、NF-κB(Cell Signaling公司);兔源一抗Notch受体胞内结构域(NICD,深圳欣博盛生物科技有限公司)。

1.3实验分组及CIRI模型构建

随机把75只C57小鼠分为假手术(Sham)组、CIRI模型(CIRI)组，青蒿琥酯组(80 mg/kg青蒿琥酯)[12]、Notch激动剂组(50 mg/kg Jagged1)[5]、青蒿琥酯+Notch激动剂组(80 mg/kg青蒿琥酯+50 mg/kg Jagged1),每组各15只，青蒿琥酯、Jagged1均于造模后10 min内通过腹腔注射给药，Sham组、CIRI组腹腔注射等体积生理盐水。采用线栓法制备CIRI模型，麻醉小鼠后于颈部正中处剪开皮肤，暴露分离右侧颈总、颈外、颈内动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉，手术线结扎颈总、颈外动脉的近心端。于距颈总动脉分叉处3～4 mm处剪一切口，缓慢插入线栓至颈内动脉，感到稍微抵触时提示线栓前端已阻断大脑中动脉(插入长度18～20 mm),于缺血2 h后缓慢抽出线栓，完成脑缺血2 h、再灌注24 h的CIRI模型。假手术组接受了相同的手术，但未插入线栓。于再灌注24 h后检测相关指标。

1.4 Longa法评估神经行为学评分

参考文献[13]对小鼠进行Longa评分：正常爬行为0分；左侧前爪不能完全伸展为1分；向左侧旋转为2分；向左侧倾倒为3分；失去意识、不能行走为4分。重复评定3次取平均值。

1.5 TTC染色检测脑梗死体积

每组随机取5只小鼠，断头处死后迅速取出整个脑组织，经预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后置于-20℃冷冻30 min,随后切成6个连续的冠状位切片，厚度2 mm,将切片置于2%TTC染液中孵育(37℃避孵育30 min),染色完成后将切片置于4%多聚甲醛中固定2 h,而后拍照，借助ImageJ软件计算脑梗死体积。脑梗死体积(%)=(正常侧半脑体积-患侧非梗死体积)/正常侧半脑体积×100%。

1.6尼氏染色、Tunel染色检测神经元损伤情况

对于尼氏染色，每组随机取5只小鼠，心脏灌流后断头取脑，分离右半脑皮层并置于4%多聚甲醛中固定24 h,随后进行石蜡包埋、切片。将切片脱蜡至水后置于1%甲苯胺蓝中染色30 min,依次进行95%酒精分化、脱色，无水乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片，于显微镜下观察，计数尼氏小体数量。对于Tunel染色，将切片脱蜡至水后置于蛋白酶K中37℃孵育20 min,而后置于3%H2O2中封闭20 min,置于Tunel反应液中37℃孵育1 h,二氨基联苯胺(DAB)显色后于显微镜下观察，采用ImageJ软件计算神经元凋亡率。

1.7免疫荧光染色检测脑组织中GFAP阳性表达情况

取脑组织石蜡切片，脱蜡至水后置于枸橼酸缓冲液中进行抗原修复，而后置于5%山羊血清中封闭20 min,孵育兔源一抗GFAP(4℃过夜),Alexa Fluor® 555标记的山羊抗兔二抗(37℃1 h),DAPI复染核室温5 min,封片后于荧光显微镜下拍照，采用ImageJ软件分析平均荧光强度，GFAP阳性表达与平均荧光强度呈正比。

1.8 ELISA检测脑组织中炎性因子水平

取每组剩余的5只小鼠，心脏灌流后断头取脑，分离右半脑皮层，经匀浆后，离心收集上清，利用ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α、IL-6水平。

1.9 Western印迹检测脑组织中Notch信号通路相关蛋白表达情况

RIPA裂解液提取脑组织总蛋白，BCA法测定浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，之后将其转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h,孵育兔源一抗Notch1、Jagged1、NICD、NF-κB、GAPDH(4℃过夜),次日孵育HRP-山羊抗兔二抗(室温1 h),置于凝胶成像系统中拍照，借助ImageJ软件分析灰度值。

1.10统计学分析

采用SPSS25.0软件进行方差分析，两两比较进行SNK-q检验。

2、结果

2.1各组脑梗死体积百分比

与Sham组比较，CIRI组脑梗死体积百分比增大(P<0.05);与CIRI组比较，青蒿琥酯组脑梗死体积百分比明显缩小，Notch激动剂组脑梗死体积百分比明显增大(P<0.05);与青蒿琥酯组比较，Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组脑梗死体积百分比明显增大(P<0.05);Notch激动剂组上述指标明显高于青蒿琥酯+Notch激动剂组(P<0.05)。见图1、表1。

2.2各组神经行为学评分

与Sham组比较，CIRI组神经行为学评分明显升高(P<0.05);与CIRI组比较，青蒿琥酯组神经行为学评分明显降低，Notch激动剂组神经行为学评分明显升高(均P<0.05);与青蒿琥酯组比较，Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组神经行为学评分明显升高(P<0.05);Notch激动剂组上述评分明显高于青蒿琥酯+Notch激动剂组(P<0.05)。见表1。

2.3各组神经元损伤情况

与Sham组比较，CIRI组尼氏体数量明显减少，神经元凋亡率明显增加(P<0.05);与CIRI组比较，青蒿琥酯组尼氏体数量明显增加，神经元凋亡率明显减少，Notch激动剂组与之明显相反(P<0.05);与青蒿琥酯组比较，Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组尼氏体数量明显减少，神经凋亡率明显增加(P<0.05);Notch激动剂组尼氏体数量明显低于青蒿琥酯+Notch激动剂组，神经凋亡率明显高于青蒿琥酯+Notch激动剂组(P<0.05)。见表1、图2。

2.4各组脑组织中GFAP阳性表达情况

与Sham组比较，CIRI组脑组织中GFAP阳性表达明显增加(P<0.05);与CIRI组比较，青蒿琥酯组脑组织中GFAP阳性表达明显减少，Notch激动剂组与之明显相反(P<0.05);与青蒿琥酯组比较，Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组脑组织中GFAP阳性表达明显增加(P<0.05);Notch激动剂组GFAP阳性表达明显高于青蒿琥酯+Notch激动剂组(P<0.05)。见表1、图3。

图1 TTC染色检测脑梗死体积

1～5:Sham组、CIRI组、青蒿琥酯组、Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组；图4同

表1各组神经行为学评分、脑梗死体积百分比、神经元损伤情况、GAFP阳性表达

图2各组神经元损伤(×200)

图3各组脑组织中GFAP阳性表达(免疫荧光染色，×200)

2.5各组脑组织中Notch信号通路相关蛋白表达情况

与Sham组比较，CIRI组脑组织中Notch1、Jagged1、NICD、NF-κB蛋白表达均明显升高(P<0.05);与CIRI组比较，青蒿琥酯组上述指标均明显降低，Notch激动剂组上述指标明显升高(P<0.05);与青蒿琥酯组比较，Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组上述指标明显升高(P<0.05);Notch激动剂组上述指标明显高于青蒿琥酯+Notch激动剂组(P<0.05)。见图4、表2。

2.6各组脑组织中炎性因子水平

与Sham组比较，CIRI组脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显升高(P<0.05);与CIRI组比较，青蒿琥酯组脑组织中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明显减少，Notch激动剂组上述指标明显升高(P<0.05);与青蒿琥酯组比较，Notch激动剂组、青蒿琥酯+Notch激动剂组脑组织中上述指标水平均明显升高(P<0.05);Notch激动剂组上述指标水平明显高于青蒿琥+Notch激动剂组(P<0.05)。见表2。

图4 Western印迹检测脑组织中Notch信号通路相关蛋白表达

表2各组炎性因子水平、Notch信号通路相关蛋白表达情况

3、讨论

神经炎症反应主要由IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎因子介导，当其水平升高后，可激活更多炎症细胞，导致中枢神经系统的常驻免疫细胞—星形胶质细胞过度活化(GFAP为其活化标志物),共同诱导神经元损伤[14]。本研究结果表明，CIRI小鼠脑组织发生了明显炎症反应和神经元损伤。

青蒿琥酯是抗疟药物青蒿素半合成的倍半萜内酯衍生物，是黄花蒿的主要活性成分之一。诸多研究表明，青蒿琥酯除了具有显著的抗疟疾作用外，还具有较好的抗炎效果[6～8]。青蒿琥酯可对CIRI发挥保护作用，Zhang等[9]发现，青蒿琥酯可通过增强神经干细胞增殖来减轻CIRI;Lu等[10]发现，青蒿琥酯对CIRI发挥保护作用可能与激活Nrf2通路和抑制ROS依赖的p38MAPK通路有关。本研究表明，青蒿琥酯可抑制神经炎症反应，减轻CIRI小鼠神经元损伤；这与既往的研究一致，再次证实青蒿琥酯的神经保护作用。

Notch信号通路有4种Notch受体(Notch1、2、3、4)和5种配体(Delta-like 1、3、4、Jagged1和Jagged2)组成，当Notch受体与其配体结合后可促使NICD释放入核，Notch信号通路被激活，其中Notch1是目前研究较为广泛的Notch信号通路[15]。已有大量研究显示，Notch信号通路激活后能够诱导游离NF-κB进入细胞核，激活促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达，诱导炎症反应，与CIRI的病理过程密切相关[4,5]。本研究结果表明，Notch信号通路激活诱导了CIRI小鼠脑组织炎症反应和神经元损伤。Liu等[11]研究显示，青蒿琥酯可通过抑制Notch信号通路发挥抗肺纤维化作用。本研究提示，青蒿琥酯对CIRI的保护作用与抑制Notch信号通路有关。

综上，青蒿琥酯能够抑制CIRI小鼠脑组织炎症反应，减轻其神经元损伤，可能通过抑制Notch信号通路而实现。本研究可为青蒿琥酯应用于CIRI的防治提供参考。

参考文献:

5刘京东,陈莎,王钰淳,等.β-石竹烯作用于Notch1/NF-κB信号轴对脑缺血再灌注损伤大鼠的改善作用[J].第三军医大学学报,2021;43(3):218-25.

8王瑞茵,李红雯,张清,等.青蒿琥酯对哮喘小鼠气道反应性和气道炎症的影响[J].中华医学杂志,2019;99(32):2536-41.

13李媛,吴增,靳晓飞,等.黄芪甲苷对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的影响[J].中国药理学通报,2018;34(1):108-12.

基金资助:河北省医学科学研究课题计划(20220371);

文章来源:张乐国,朱翠敏,夏瑞雪,等.青蒿琥酯调节Notch信号通路对脑缺血再灌注小鼠神经元损伤的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(22):5531-5535.