睡眠剥夺(SD)是指由于外界环境或自身原因导致的睡眠丢失，表现为睡眠减少和(或)睡眠的连续性中断。随着我国人口老龄化日益加剧，各种原因引起的睡眠时间减少、睡眠效率降低、睡眠障碍导致的SD在老年人群中发生率逐渐增高[1,2]。睡眠质量的好坏直接影响到老年人的身心健康与生活质量[3]。不同程度的SD可引起情绪控制、学习记忆、免疫功能等改变[4]。一项回顾性研究显示，睡眠障碍患者与其神经退行性疾病发生发展密切相关[5]。更有研究表明，睡眠能促进记忆巩固，而睡眠障碍则会导致认知能力下降和阿尔茨海默病(AD)等神经退行性疾病的患病风险增加[6],但是具体机制目前不明。

人同源盒基因(OTX)1属于OTX基因家族，是脊椎动物中与果蝇orthodenticle基因同源的一类基因，在哺乳动物大脑皮质和感觉器官的发育过程中发挥重要作用[7]。OTX1是脊椎动物大脑皮层发育过程中至关重要的同源框转录因子，参与大脑皮质的神经发育调节[8],并且在神经前体细胞增殖、分化及其神经元成熟过程中扮演重要角色，在啮齿类动物胚胎中，OTX1表达在发育早期大脑皮质神经前体细胞及出生后的皮质神经元中，在发育期大脑皮质，敲减OTX1可增加增殖期的神经前体细胞，同时减少皮质神经元的生成[9]。研究提示，OTX1可能参与调节神经发育等相关的细胞分化与细胞凋亡等细胞跨膜信号转导过程[10]。有研究显示，SD相关的认知功能障碍与大脑皮层及海马神经元的病理生理变化密切相关[11],但是OTX1在该病理生理变化中是否有关联作用还未见报道。因此，本研究以OTX1在小鼠大脑皮层及海马神经元中表达及分布特征为切入点，建立SD模型，采用行为学实验方法评价SD对小鼠认知功能的影响，免疫荧光法和Western印迹法分析OTX1在SD后大脑皮层和海马神经元中的表达及其分布特征变化，试图分析OTX1与SD二者之间的关联作用，为SD后认知功能障碍的防治提供新的靶点。

1、材料和方法

1.1实验动物

为了排除雌激素的影响，以湖北医药学院动物实验中心提供的6月龄雄性野生型(WT) C57BL/6小鼠为研究对象。将WT小鼠随机分为两组：大平台对照(Ctrl)组、小平台SD(SD)组，每组12只。动物均在12 h/12 h明暗交替的SPF级动物房中饲养，每笼5～6只，小鼠可自由饮水和进食，室温24～26℃,湿度50%～60%。本研究动物实验方案经湖北医药学院动物伦理委员会审批。

1.2主要实验试剂

胞核胞质提取试剂盒VF302546购于Thermo公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)配制试剂盒[30%Acr-Bis、10%AP、1 mmol/L Tris, pH8.8、1 mmol/L Tris, pH6.8、10%SDS、四甲基乙二胺(TEMED)]购自碧云天生物科技公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自ThermoFisher Scientific公司；兔抗OTX1抗体购自Abcam公司(ab1209);兔抗α-tublin抗体和辣根酶标记的羊抗兔Ⅱ抗购自武汉安特捷生物技术有限公司。

1.3快速动眼SD

采用改良多平台SD法进行持续72 h的快速动眼期(REM)SD。SD组使用的SD水槽(48 cm×39 cm×19.5 cm)包含12个小平台(平台直径3 cm,高度5 cm),各个平台间隔3 cm;小鼠在平台上可正常获取食物和饮水；水槽内水平面位于平台平面下1 cm处，小鼠通过四肢抓站在平台上，进入REM睡眠时四肢肌张力降低触水即醒，从而实现REM的SD。Ctrl组使用大平台，大平台直径足够大，小鼠可以正常饮食活动、休息。

1.4 Morris水迷宫实验

实验前1 d,不放置平台，让小鼠自由游泳60 s,训练完毕后立即取出小鼠并擦干以避免应激反应。将不同标记物分别贴在4个象限，水温控制在(20.0±2)℃,并用二氧化钛将水染成乳白色。实验第一天(平台可见期):将平台放置在水面以上1 cm处，将小鼠在平台所在象限之外的3个象限随机面对池壁放入水中，当小鼠找到平台后，记录成功潜伏期，并在平台上停留15 s;如果小鼠在60 s内未找到平台，成功潜伏期记为60 s,并引导小鼠在平台上停留30 s,让其根据4个象限的参照物进行空间学习记忆。实验第2～5天(平台隐藏期):将平台放置在水面以下1 cm处，放置小鼠及记录方法同平台可见期(剔除连续3 d未找到平台小鼠数据);实验第6天(无平台期):撤去平台，将小鼠在平台所在象限之外的3个象限随机面对池壁放入水中，观察并记录60 s内小鼠穿越原平台所在区域次数及在原平台所在象限停留时间。记录小鼠的游泳速度、成功潜伏期、平台所在象限停留时间百分比等指标。

1.5新事物认知实验

用于检测小鼠的物体识别记忆能力，在SD 72 h后第2天进行。实验分为熟悉和测试两个阶段。熟悉阶段时在旷场中放置两个完全相同的物体，两物体间距20 cm,与两侧壁相距20 cm。依次将小鼠从同一位置面壁放入旷场，任其自由探索5 min,活动结束后将小鼠放回笼内休息。2 h后进行测试阶段实验，此时将旷场中的一个物体换成另一材质相同，但形状和颜色均不同的新物体，再依次按照相同顺序将小鼠从同一位置放入旷场，任其自由探索5 min,记录每只小鼠接触新旧物体的时间并计算新事物识别指数(RI)。RI=探索新物体时间/(探索新物体时间+探索旧物体时间)×100%。

1.6组织免疫荧光染色

在SD 72 h后，每组立即随机选取3只小鼠，5%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，磷酸盐缓冲液(PBS,0.01 mol/L,pH7.2～7.4)和4%多聚甲醛灌注后取脑，4%多聚甲醛后固定24 h,流水冲洗过夜，脱水、透明后石蜡包埋，常规石蜡切片(5μm)后烤片、脱蜡、水化后加入0.01 mol/L柠檬酸钠(pH6.0)进行95℃抗原修复15 min, 10%血清(种属对应二抗)封闭液室温封闭1 h,滴加一抗OTX1(1∶200),4℃孵育过夜，次日滴加二抗(红色荧光素标记的羊抗兔IgG,1∶500)室温孵育1 h, 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,1∶200)染核15 min,使用含防荧光淬灭剂的甘油-PBS封片，荧光显微镜(EVOS FLc)观察、拍照，并在40倍镜下，以细胞核为边界，利用ImageJ8.0软件半定量统计分析OTX1在两组皮层及海马神经元细胞核荧光强度。

1.7 Western印迹实验

在SD 72 h后，每组立即随机选取3只小鼠断头处死，分离出大脑皮层及海马，使用胞核胞质蛋白提取试剂盒分别提取大脑皮层及海马的胞核、胞质蛋白。将所获蛋白用BCA法将蛋白浓度调至一致后，与5×上样缓冲液混匀，金属浴煮沸10 min,取10μg蛋白经10%SDS-PAGE胶电泳后，湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(220 mA、100 min),5%脱脂奶粉室温封闭1 h,一抗OTX1(1∶1 000)4℃摇床过夜，用辣根过氧化酶标记的Ⅱ抗(1∶10 000)室温孵育1.5 h, 0.01 mol/L PBS漂洗后，用双荧光成像系统(Bio-Rad, ChemiDoc XRS+)显影，Image Studio软件成像，ImageJ8.0软件测定相关蛋白条带光密度值。

1.8统计学处理

采用GraphPad Prism8.0软件进行分析，实验数据均为至少3次独立重复实验结果，两组间均数比较采用Studentt检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2、结 果

2.1 OTX1在正常小鼠大脑皮层神经元和海马各区神经元的表达分布特征

免疫荧光染色显示，OTX1呈中至高水平表达在Ctrl组大脑皮层和海马CA1区、CA3区、DG区中；在大脑皮层，OTX1主要定位于神经元核内，细胞质内OTX1免疫反应性相对较弱；而在海马CA1区、CA3区和DG区中，OTX1则主要位于神经元胞质内，神经元核内OTX1免疫反应性极弱(图1)。

图1正常小鼠大脑皮层神和海马各区内OTX1表达(免疫荧光，×40)

红色荧光为OTX1阳性结果，蓝色荧光为DAPI染细胞核；图2同

2.2 SD对学习记忆等认知功能的影响

SD后，小鼠RI显著下降(0.75±0.14 vs 0.50±0.12,t=4.303、P=0.032),即SD损伤了小鼠新事物认知的能力。Morris水迷宫实验显示，SD后，Morris水迷宫实验第1～5天小鼠寻找同一象限平台的潜伏期显著延长(P<0.05),即小鼠学习能力显著下降(表1);Morris水迷宫实验第6天，撤去平台后，SD组穿越原平台次数及其在原平台所在象限游泳时间较对照组显著减少[(3.460±1.12) vs (1.834±0.23)次，t=2.776、P=0.039;(14.12±2.36)vs (12.53±2.14)s,t=3.182、P=0.036],即小鼠记忆能力显著下降。

表1两组成功找到平台潜伏期

2.3 SD逆转OTX1在小鼠大脑皮层及海马神经元中的核质分布

OTX1免疫荧光染色显示，与Ctrl组比较，SD组皮层神经元内OTX1主要位于细胞质，核内分布明显减少；海马CA1区、CA3区和DG区神经元内OTX1主要位于细胞核，胞质内定位明显减少。见图2。免疫荧光强度半定量分析显示，在小鼠大脑皮层神经元，SD组细胞核内OTX1免疫反应性较Ctrl组明显减弱，而在海马各区神经元，SD组显著高于对照组(均P<0.001)。OTX1免疫荧光阳性细胞核定量分析显示，在小鼠大脑皮层神经元，SD组OTX1阳性细胞核较Ctrl组明显减少，而在海马各区神经元，SD组较Ctrl组显著增多(均P<0.001)。见表2。Western印迹显示，OTX1在皮层神经元细胞质中蛋白相对表达显著低于海马神经元细胞质中蛋白相对表达，SD后OTX1在皮层神经元胞质蛋白中相对表达显著升高，而在海马神经元胞质蛋白中相对表达则显著降低(P<0.01)。OTX1在皮层神经元细胞核中蛋白相对表达显著高于海马神经元细胞核中蛋白相对表达，SD后OTX1在皮层神经元胞核蛋白中相对表达显著降低，而在海马神经元胞核蛋白中相对表达显著升高(P<0.001)。见图3、表3。

图2两组皮层及海马神经元中的OTX1表达和核质分布(免疫荧光，×40)

表2两组皮层及海马神经元细胞核内免疫荧光强度及OTX1阳性神经细胞核数目定量分析

图3 Western印迹检测两组OTX1蛋白在小鼠皮层及海马神经元表达和核质分布

表3两组皮层及海马神经元细胞质及细胞核中OTX1蛋白相对表达

3、讨 论

OTX1是一种在脊椎动物大脑皮层发育过程中起关键作用的转录因子[12],研究提示，OTX1在胚胎、感觉器官、视网膜发育中起重要作用[7]。在胚胎早期，前神经外胚层发育为前脑和中脑时，OTX1开始表达，胚胎后期，OTX1在皮层脑室区和新生皮层板中表达，同时它也存在于侧脑室的脉络丛、脑室区、海马和小脑中[13],表明OTX1广泛表达于脊椎动物的中枢神经系统。同时OTX1在调控大脑功能的维持和区域化方面发挥关键作用[14]。大脑皮层及海马神经元与学习和记忆等认知功能密切相关，也最为普遍，已经证实海马是快速、暂时性记忆信息存储部位，而大脑皮层是缓慢、持久性记忆信息存储部位[15]。本研究发现，OTX1不仅在成年小鼠大脑皮层及海马神经元均有表达，而且OTX1在大脑皮层神经元中以细胞核分布为主，在海马神经元中以细胞质分布为主，该核质分布特征属首次报道，但这是否与皮层、海马密切相关的学习记忆等认知功能相关仍不清楚。但基于大脑皮层及海马在学习记忆中关键作用，本文推测，OTX1的核质分布可能参与了生理或病理条件下大脑学习记忆等认知功能。

研究表明，正常规律的睡眠有利于清除大脑内神经毒性代谢产物及学习记忆相关突触的形成与维护[16],SD主要通过对中枢神经系统的突触可塑性、脑内化学物质代谢、海马及大脑皮层神经元造成伤害从而影响学习记忆等认知功能[17]。本研究利用经典的多平台REM的SD实验方法[10,18,19],结果与既往研究[20～22]一致，表明成功建立SD认知功能损伤模型。本研究提示，OTX1在小鼠大脑皮层及海马神经元中的表达分布特征及在SD致学习记忆损伤时的变化可能参与正常学习记忆的形成与维持及在SD等病理条件下学习记忆等认知功能损伤的发生、发展。

既往研究显示，不同程度的SD可使小鼠在空间学习后海马及大脑皮层内突触数量减少、突触活性区面积减小、突触可塑性降低而导致记忆功能减退[10];SD受试者大脑存在额叶皮层脑电活动异常及双侧海马神经元功能的改变，这些产生变化的脑区与空间感知、学习记忆和推理有关[23]。研究发现，OTX1基因突变可以造成大脑皮层成熟神经元减少[14],海马神经元突触表面积、体积及分节体积显著降低。本研究发现，SD后伴随着学习记忆等认知功能损害，OTX1在皮层及海马神经元中的表达及核质分布发生逆转性变化。以上结果提示，SD后OTX1在皮层及海马神经元中的核质再分布可能通过影响突触的结构与功能而参与SD导致的认知功能受损的过程，但这种OTX1核质分布差异性改变是如何产生的及如何影响学习记忆等认知功能是未来研究需要解决的问题。

综上，基于在正常及SD小鼠大脑皮层和海马体神经元内OTX1表达及其核质分布的特征及其独特改变，可推测小鼠大脑皮层及海马体神经元中的OTX1参与了SD过程中空间记忆、学习能力等认知功能受损的调节，揭示这一调控机制，为认识SD影响学习记忆的神经生物学机制提供新的防治靶点。

参考文献:

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3屈杜洁.Wnt/β-catenin信号介导的海马神经元发生参与睡眠剥夺及脑创伤导致的认知功能下降[D].西安:中国人民解放军空军军医大学,2019.

7吕锦,曲春生,蓝丽康.OTX1基因多态性与特发性癫痫的相关性研究[J].浙江实用医学,2020;25(1):33-5.

9 Malik YS.环指蛋白10调节干细胞的细胞周期阻滞和向神经元定向分化[D].长春:东北师范大学,2013.

13杨春艳.下调OTX1的表达抑制非小细胞肺癌发生发展的功能与分子机制研究[D].昆明:云南大学,2020.

17刘威,胡克.睡眠剥夺与多系统相关疾病关系的研究进展[J].医学综述,2021;27(23):4696-701.

20倪丽艳.下调海马Orexin受体对急性睡眠剥夺大鼠学习记忆和海马神经发生的影响及机制研究[D].济南:山东大学,2022.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(82270299);湖北省科技厅项目(2018ACA162,2021DFE026);

文章来源:杨茜,张盈杰,王熙蕊,等.小鼠大脑皮层及海马中OTX1表达分布特征及其在睡眠剥夺学习记忆损伤中的变化[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5249-5255.