失眠障碍属于全球性健康问题，是神经内科临床常见的疾病，对认知、情绪和人际关系功能产生负面影响，干扰了学习记忆的形成和巩固[1,2]。根据流行病学调查显示，中国成人失眠障碍的发病率高达10%～15%，且呈慢性化病程，近半数严重失眠可持续10年以上[3]。目前，镇静类抗抑郁药物、褪黑素受体激动剂、镇静类抗精神病药物等是治疗失眠的一线药物，但长期服用后易引起药物耐受性、依赖性、成瘾性等方面的不良反应，影响了患者的身体健康[4]。

疏肝健脾养心方由小柴胡汤、归脾汤、逍遥散化裁而来，具有疏肝健脾、养心安神的作用，可用于不寐等疾病的治疗[5]。前期研究显示，疏肝健脾养心方对于失眠伴轻度焦虑患者疗效颇佳，其机制可能与槲皮素、黄芩素、山柰酚等有效化合物成分对丝裂原活化蛋白激酶8、白细胞介素-6、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等与焦虑相关基因的调节有关[5,6]，但其分子机制尚未完全阐明。食欲素（OX）有OXA和OXB 2种亚型，OXA和OXB以相似的亲和力结合OX受体2(OX2R),OXA对OX受体1(OX1R）的亲和力比OXB高，为OX1R与OXB亲和力的100～1 000倍[7]。OXA通过与OX1R和OX2R结合，引起钙离子及环磷酸腺苷水平的变化，并调控下游细胞外调节蛋白激酶的活性，从而发挥调节睡眠觉醒、食欲、奖惩等作用[8]，与脾主思、运化食物和水液的中医内涵颇为相似。基于此，本研究拟通过构建失眠小鼠模型，观察疏肝健脾养心方调控失眠小鼠OXA及其受体的表达，分析其治疗失眠的机制，为本方的临床应用提供科学依据。

1、材料

1.1 动物

SPF级雌性BALB/c小鼠50只，8周龄，体质量（23±2)g，购于斯贝福生物技术有限公司，合格证号SYXK（豫）2020-0004。动物置于室温（23±1.5）℃、相对湿度50%～60%的环境中饲养，自由摄食饮水，12 h昼夜交替循环。实验方案经河南中医药大学第一附属医院动物伦理委员会批准（编号DWLL202110009）。

1.2 药品及试剂

疏肝健脾养心方方药组成：柴胡10 g、黄芩9 g、当归10 g、栀子10 g、白芍15 g、炒白术15 g、茯苓15 g、党参10 g、炒酸枣仁15 g、龙眼肉15 g、炙甘草10 g，所有饮片、颗粒剂均购买于江阴天江药业有限公司，批号分别为21032211、21036191、21096624、21007191、21076574、2107010w、21056414、21000352、21046514、201201、21096054，该药物剂量以既往发表的文献为依据[5,6]；右佐匹克隆（北京斯利安药业有限公司，批号H11020249）；对氯苯丙氨酸（PCPA，美国Sigma公司，批号C6506）；抗OXA抗体（英国Abcam公司，批号ab255294）；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠免疫球蛋白（Ig)G(H+L）（碧云天生物科技有限公司，批号A0216);OXA、5-羟色胺（5-HT）酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号分别为ml037893、ml001891）；总RNA抽提试剂盒、c DNA逆转录试剂盒及反转录试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司，批号分别为11202ES08、11123ES60）。

1.3 仪器

FLUO star OPTIMA型多功能酶标仪（德国BMG Labtech公司）；Light Cycler 96型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪（瑞士Roche公司）；Chemidoc MP型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；Morris型水迷宫（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

2、方法

2.1 药物制备

龙眼肉15 g加超纯水300 m L，煎煮1 h，然后将加疏肝健脾养心方其他颗粒剂药物按照比例加入到龙眼肉水煎剂中，浓缩至1 g·m L-1的混悬液。右佐匹克隆粉碎后，加入纯水，配制成0.2 g·L-1的混悬液。PCPA用0.9%Na Cl配制成0.5 g·m L-1的混悬液。以上药液均置于-20℃冰箱保存备用。

2.2 分组、造模与给药

50只SPF级BALB/c雌性小鼠，适应性饲养1周。通过随机数字法分为空白组、模型组、右佐匹克隆组（0.13 mg·kg-1·d-1）、疏肝健脾养心方低、高剂量组（8.4、33.6 g·kg-1·d-1），每组10只（疏肝健脾养心方低、高剂量组分别是临床等效剂量的1、4倍）。除空白组外的4组小鼠，通过腹腔注射PCPA(300 mg·kg-1，每日1次），连续3 d，建立失眠小鼠模型[9]。当小鼠的昼夜节律异常，睡眠减少直至消失，且出现精神萎靡，攻击性强，易激惹，毛发蓬松杂乱，进食减少时，表明造模成功[10]。造模成功后，空白组与模型组小鼠给予纯水灌胃，其余小鼠给予相应的药物治疗。小鼠的给药剂量是按照人和小鼠间体表面积折算的等效剂量计算。给药第9天进行水迷宫实验，给药第13、14天进行戊巴比妥钠协同睡眠实验。实验结束后，小鼠麻醉后处死。小鼠全血离心后，取血清，-80℃保存备用。下丘脑、脾脏-80℃保存备用。

2.3 Morris水迷宫实验

给药第9天进行Morris水迷宫实验。Morris水迷宫实验中主要分为定位航行实验和空间探索实验。实验开始前，水迷宫注水，保持水温（20±1）℃，水深超过平台2 cm，平台放在第三象限（目标象限）正中位置。定位航行实验：将小鼠面向池壁放于水中，放入位置为第一到第四象限的正中贴壁处。如果小鼠在60 s内无法找到平台，则引导小鼠到平台，停留10 s；在60 s内小鼠找到平台，则本次定位航行实验结束。仪器自动记录小鼠找到水中平台的时间，即逃避潜伏期，以此作为学习记忆能力的检测指标。每只小鼠每天训练4次，连续训练5 d。空间探索实验：实验第6天将平台撤除后，将小鼠由第一象限放入水中，记录小鼠60 s跨越原平台位置的次数和目标象限持续时间。

2.4戊巴比妥钠协同睡眠实验

小鼠给药第13天，根据前期预实验确定90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠阈下用量为60 mg·kg-1体质量，5组均腹腔注射阈下剂量的戊巴比妥钠。小鼠给药第14天，根据前期预实验确定小鼠100%入睡，但又不使睡眠时间过长的戊巴比妥钠剂量为100 mg·kg-1体质量，5组均腹腔注射阈上剂量的戊巴比妥钠。记录小鼠睡眠情况。

2.5 ELISA检测下丘脑、血清、脾组织中OXA和5-HT的变化

脾和下丘脑组织称重、匀浆，脾脏组织按1∶1比例加入组织裂解液，下丘脑组织按1∶2比例加入组织裂解液，然后取上清。根据ELISA试剂盒的说明书，测定下丘脑、血清、脾组织中OXA和5-HT的水平。使用酶联免疫检测器以450 nm的吸光度A评估所有OXA和5-HT的含量。

2.6 IHC检测下丘脑OXA含量

小鼠下丘脑组织用多聚甲醛固定后，石蜡包埋，冠状切片，冻存，脱蜡至水，漂洗，孵育，加一抗（1∶1 000）、二抗（1∶200），漂洗并晾干，使用荧光显微镜观察并记录，使用Image J进行统计分析，计算阳性区域的平均光密度值，比较各组蛋白的表达量。

2.7 Real-time

PCR检测下丘脑中OXA、OX1R和OX2R m RNA表达下丘脑组织总RNA的提取，按照总RNA快速提取试剂盒的操作流程。组织称重后，加入组织专用裂解液，研磨，12 000 r·min-1离心15 min（离心半径10 cm），取上清，-80°C保存。按照逆转录试剂盒的说明书将RNA进行逆转为c DNA。接着按照PCR试剂盒操作说明将c DNA进行扩增。反应条件：设置变性温度为94°C、30 s，随后变性温度为94°C、5 s，退火温度为60°C、30 s，共40个循环的反应参数。所有的数据分析采用2-ΔΔCt方法。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参对照。见表1。

2.8 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料以表示，使用单因素方差分析（ANOVA）与纽曼-凯尔斯测验（多组间）进行计算和分析数据。P<0.05为差异有统计学意义。  

表1 引物序列  

3、结果

3.1 疏肝健脾养心方对小鼠体质量的影响

造模前各组小鼠体质量差异无统计学意义。与空白组比较，模型组小鼠体质量显著降低（P<0.01）。与模型组比较，右佐匹克隆组和疏肝健脾养心方低、高剂量组小鼠体质量明显升高（P<0.05,P<0.01）。与右佐匹克隆组比较，疏肝健脾养心方高剂量组小鼠体质量明显升高（P<0.05,P<0.01）。见表2。

3.2 疏肝健脾养心方对小鼠逃避潜伏期、穿越平台次数、象限活动时间的影响

与空白组比较，模型组小鼠逃避潜伏期时间显著增加（P<0.01）；与模型组比较，右佐匹克隆组和疏肝健脾养心方低、高剂量组小鼠逃避潜伏期时间显著减少（P<0.01）。见表3。 

表2 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠体质量变化的影响 

表3 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠学习记忆能力的影响  

3.3 戊巴比妥钠协同睡眠实验

3.3.1 疏肝健脾养心方对阈下剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠入睡率的影响

与空白组比较，各组小鼠入睡率均有升高。与模型组比较，右佐匹克隆组和疏肝健脾养心方低、高剂量组小鼠入睡率均有升高。与右佐匹克隆组比较，疏肝健脾养心方高剂量组小鼠入睡率有所升高。见表4。

3.3.2 疏肝健脾养心方对阈上剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠潜伏期、睡眠持续时间的影响

与空白组比较，模型组小鼠睡眠潜伏期显著增加，睡眠持续时间显著减少（P<0.01）。与模型组比较，右佐匹克隆组和疏肝健脾养心方低、高剂量组小鼠睡眠潜伏期显著减少，睡眠持续时间显著增加（P<0.01）。与右佐匹克隆组比较，疏肝健脾养心方低剂量组小鼠睡眠潜伏期显著增加，睡眠持续时间显著减少（P<0.01）；疏肝健脾养心方高剂量组小鼠睡眠持续时间明显增加（P<0.05）。见表5。  

表4 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠阈下剂量戊巴比妥钠所致入睡率的影响 

3.4 疏肝健脾养心方对小鼠下丘脑、血清、脾脏组织中OXA和5-HT含量的影响

与空白组比较，模型组小鼠下丘脑、血清、脾脏组织中5-HT含量明显降低，而OXA含量明显升高（P<0.05）。与模型组比较，右佐匹克隆组和疏肝健脾养心方低、高剂量组小鼠下丘脑、血清、脾脏中5-HT含量升高，OXA含量下降（P<0.05,P<0.01）。见表6、表7。

3.5 疏肝健脾养心方对小鼠下丘脑组织中OXA免疫组化的影响

与空白组比较，模型组OXA含量明显升高、聚集，平均光密度显著升高（P<0.01）。与模型组比较，右佐匹克隆组和疏肝健脾养心方低、高剂量组小鼠下丘脑中平均光密度显著下降，OXA含量显著降低（P<0.01）。与右佐匹克隆组比较，疏肝健脾养心方高剂量组小鼠下丘脑平均光密度显著下降，OXA含量显著降低（P<0.01）。见图1、表8。  

表5 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠阈上剂量戊巴比妥钠致睡眠的影响   

表6 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠下丘脑、血清、脾脏组织中5-HT含量的影响  

表7 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠失眠小鼠血清、脾脏、下丘脑组织中OXA含量的影响  

图1 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠下丘脑中OXA免疫组化的影响（免疫组化，×40)   

表8 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠下丘脑组织中OXA免疫组化的影响 

3.6 疏肝健脾养心方对小鼠下丘脑组织中OXA及其受体m RNA的影响

与空白组比较，模型组小鼠OXA、OX1R、OX2R m RNA表达显著升高（P<0.01）。与模型组比较，右佐匹克隆组和疏肝健脾养心方高剂量组小鼠下丘脑中OXA、OX1R、OX2R m RNA含量显著降低（P<0.01）；疏肝健脾养心方低剂量组小鼠下丘脑中OXA m RNA表达显著下降（P<0.01）。与右佐匹克隆组比较，疏肝健脾养心方低剂量组小鼠下丘脑中OX1R、OX2R m RNA表达明显升高（P<0.05,P<0.01）。见表9。 

表9 疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠下丘脑中OXA、OX1R和OX2R m RNA的影响 

4、讨论

失眠是临床常见的睡眠障碍问题，包含入睡困难，反复醒来，睡眠质量差，整体睡眠时间短[11,12]。失眠患者更容易患上焦虑和抑郁症，严重影响患者的社会功能及生命质量，罹患心脑血管疾病、糖尿病的风险也大幅提高[13,14,15]。目前失眠的发病机制研究主要包括神经递质紊乱，下丘脑功能障碍，褪黑激素系统功能下降，觉醒促食素系统等[16,17,18]。中医学将失眠归属于“不得卧”“不能眠”等范畴，认为人之寤寐由心神控制，以阴阳为纲领，受营卫所调节，五脏气血阴阳与睡眠密切相关。其中“情志不畅、肝失疏泄”是不寐的关键病因思虑伤脾，脾不藏意是不寐的另一重要病机，若人体劳倦思虑过度、饮食情志失常，可损脾胃之气，气血生化伐源，营血不足，不能上奉于心，致心神失养而不寐。本研究基于动物失眠模型，探索名老中医经验方疏肝健脾养心方治疗慢性失眠障碍的临床疗效，以期为现代中医治疗慢性失眠障碍的综合疗法开拓新的思路。

疏肝健脾养心方，又名“三调方”，是国家级名老中医张怀亮教授的经验方，是由小柴胡汤、归脾汤、逍遥散化裁而来，具有疏肝健脾、养心安神的作用，临床常用于不寐、焦虑、抑郁等疾病的治疗[5,19]。方中柴胡为君药，具有调达肝气、疏肝解郁的功效；当归及白芍、黄芩为臣药，其中当归可活血、养血，白芍可养血、柔肝，与柴胡配伍可滋养肝体，黄芩可清肝火，与柴胡配伍使用，使少阳经畅达，具有宣通三焦的功效；茯苓、党参、白术、酸枣仁及龙眼肉为佐药，具有安心神、养心血的功效，茯苓能利水安神，党参益气养心，白术健脾和胃，酸枣仁养血安神，龙眼肉补心益脾，共同发挥滋养心神、安定情绪的作用；栀子为佐使药，栀子清热燥湿，共同助益调理脾胃，改善湿热之邪；炙甘草为使药，可调和诸药。纵观全方，选药精当，“疏肝清热，健脾化湿，养心安神”，用之切证，治疗失眠障碍，疗效确切。

本实验采用腹腔注射PCPA构建失眠模型，观察疏肝健脾养心方对PCPA致失眠小鼠睡眠的影响及其作用机制。右佐匹克隆，具有见效快、代谢快、毒性及成瘾性小等优点，已成为临床上的首选药物。目前循证医学上推荐优先级别最高的是右佐匹克隆，而且在临床中使用右佐匹克隆不易产生药物依赖性，比苯二氮卓类、具有镇静作用的抗抑郁剂等药物更安全，所以选用右佐匹克隆作为阳性药的用药。造模后，小鼠体质量显著降低，逃避潜伏期时间增加，血清、脾脏、下丘脑组织中OXA的含量增加，而5-HT的含量下降，上调了下丘脑组织中OXA、OX1R、OX2R m RNA的表达。经疏肝健脾养心方干预14 d后，显著提高小鼠体质量，缩短逃避潜伏期时间，提高入睡率，减少睡眠潜伏期，增加睡眠持续时间，减少了下丘脑、血清、脾脏组织中OXA的含量，提高了下丘脑、血清、脾脏组织中5-HT的含量，抑制了下丘脑中OXA、OX1R、OX2R m RNA的表达。说明经疏肝健脾养心方治疗后，失眠小鼠的症状明显改善，相关指标的变化也说明了疏肝健脾养心方治疗失眠的有效性。

在增多失眠小鼠目标象限活动时间，缩短睡眠潜伏期方面，右佐匹克隆组优于疏肝健脾养心方低、高剂量组；在增加加睡眠时间、减少逃避潜伏期、增加穿越站台次数方面，疏肝健脾养心方高剂量组优于右佐匹克隆组，说明疏肝健脾养心方和右佐匹克隆改善学习记忆障碍和失眠障碍各有优势。在改善失眠小鼠下丘脑、血清、脾脏组织中的OXA、5-HT含量及OXA受体m RNA方面，疏肝健脾养心方和右佐匹克隆各有优势，说明二者从神经递质层面改善失眠障碍是有效的，也与上文行为学的结果相吻合，提示未来从OXA系统和5-HT相关通路继续研究疏肝健脾养心方治疗失眠障碍是可行有效的。

OX及其受体OX1R和OX2R组成了多功能的中枢食欲素系统，参与睡眠-觉醒周期、摄食调节、学习记忆等机体重要生理过程，及多种神经系统疾病的病理过程中[20]。OXA合成于下丘脑外侧-后穹孔周围的神经元[21]，是由33个氨基酸组成的神经肽，包含由4个半胱氨酸残基形成的两套链内二硫键，其氨基酸序列在人、大鼠、小鼠、牛、猪等哺乳动物体内完全相同[22];OXA作用于促进觉醒和抑制快速动眼睡眠（REM）区域，通过OX1R和OX2R这2个G蛋白偶联受体，激活去甲肾上腺素能神经元、组胺能神经元等促觉醒神经元维持机体觉醒状态，调节睡眠-觉醒周期，同时OXA神经元也会受到这些神经递质的反馈调节[23]。此外，一款双重OX1R和OX2R抑制剂suvorexant可用于失眠的治疗，通过竞争性地阻断OX1R和OX2R与Orexin的结合，使大脑从清醒到睡眠，可显著改善入睡困难及睡眠维持困难。OX在调节饮食和睡眠-觉醒方面的作用，与中医学藏象理论“脾主运化”“脾主思藏意”具有显著的相似性，是“脾主运化”“脾主思藏意”学说的微观表现，体现了中医理论的物质基础。在本实验中，经疏肝健脾养心方治疗后，小鼠在睡眠潜伏期、总睡眠时间和睡眠质量方面也均有显著改善，下丘脑组织中OXA的含量下降，下丘脑组织中OXA及其受体的表达下降，从而促进和改善睡眠。

5-HT又名血清素，广泛存在于人体组织中，特别在大脑皮层质及神经突触内含量很高，参与了各种精神活动的调节，可引发睡眠[24]。研究表明，OX神经元可以通过激活中缝背核中的5-HT能神经元来增强前额皮层中5-HT的释放，从而促进异氟醚麻醉期间的觉醒，说明OX和5-HT神经元可以对睡眠-觉醒产生影响[25]。DONG等[26]研究表明酸枣仁汤加减可通过增加失眠小鼠下丘脑中5-HT含量，下调失眠小鼠血清OXA含量及下丘脑OX2R表达，从而改善失眠模型小鼠的睡眠。本次的研究也表明，疏肝健脾养心方能够显著下调OXA及其受体的表达，及增加5-HT的含量，改善失眠模型小鼠的睡眠质量。

综上所述，疏肝健脾养心方能够改善PCPA致失眠模型小鼠的学习记忆能力及昼夜节律紊乱，其作用途径与调节OXA及其受体表达和5-HT含量有关。本研究基于现代分子生物学技术，阐释了“肝主疏泄”“脾主思藏意”的中医藏象理论，为疏肝解郁、健脾养心的治法理论提供科学依据，也为疏肝健脾养心方的临床应用提供支持。

参考文献:

[5]王峰,赵松伟,张怀亮.三调汤治疗失眠的临床疗效及经济学价值[J].国医论坛,2021,36(4):27-29.

[6]刘飞祥,林子璇,张怀亮,等.基于网络药理学分析加味归脾汤治疗阴火失眠伴焦虑的机制[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(20):161-168.

[9]肖成荣,马增春,李海静,等. PCPA失眠大鼠模型的制作及其机制[J].毒理学杂志,2007(4):326.

[10]杜鹤,刘佳星,闫艳,等.整合代谢组学与肠道菌群分析酸枣仁汤改善失眠大鼠的作用机制[J].中国中药杂志,2022,47(24):6741-6752.

[15]李悦,王慧,姚欣雨,等.酸枣仁汤对PCPA失眠大鼠学习记忆功能及海马突触可塑性相关蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(8):12-20.

[19]杨蒙蒙,李丹,张怀亮.三调汤对失眠伴焦虑患者血清因子及HTR1A､HTR2C､DRD2表达的影响[J].国医论坛,2022,37(5):28-31.

基金资助:国家中医药传承创新专项(2022JDZX004,2022CCCX008);

文章来源:王震,张杰,刘飞祥,等.疏肝健脾养心方对失眠模型小鼠食欲素A及其受体的干预作用[J].中国实验方剂学杂志,2024,30(10):54-61.