不寐即失眠,《黄帝内经》中亦称目不暝、不得卧、不得眠等,而“不寐”病名始见于《难经》[1]。《灵枢·口问》云“阳气尽,阴气盛,则目暝;阴气尽而阳气盛则寤矣”,指出不寐与阴阳的关系,阳盛阴衰故不寐。《类证治裁》总结其病机为“阳不交阴”[2]。说明正常的寤寐是人体阴阳平衡的结果,阴阳失调时,可致气血失和,阳不交阴遂发不寐。因此,治疗不寐应以调节气血阴阳为基本方法。

姚娓教授是第五批全国中医临床优秀人才,辽宁省青年名中医,从事中医临床工作近二十年,精于辨证,善于用药,对不寐病的诊治经验丰富、效果显著。姚娓教授认为不寐的核心病机为“脾虚肝郁,气血不和,神魂不安”。现将姚娓教授的不寐临床医案录入“中医传承辅助平台”,辅助分析姚娓教授治疗不寐的组方规律和用药特点,并运用网络药理学方法对中药作用靶点进行科学预测,通过网络药理学中“多基因-多靶点-复杂疾病”模式的分析优势,进一步探究姚娓教授诊治不寐的常用中药的作用机制,为不寐病的诊疗提供参考[3]。

1、资料与方法

1.1处方来源

筛选2018年3月—2020年12月就诊于大连医科大学附属第二医院中医科姚娓教授门诊的不寐病患者(首诊病例),共200例。

1.2诊断标准

西医诊断标准参照《中国精神障碍分类及诊断标准》[4]中“失眠”的诊断标准;中医参考《中医内科病证诊断疗效标准》[5]中“不寐”的诊断标准。

1.3纳入标准

符合诊断标准;有完整的病历记录及处方用药记录;临床治疗效果有良好反馈者。

1.4排除标准

由于器质性疾病如甲状腺机能亢进、嗜铬细胞瘤等继发的失眠症患者;合并严重疾病,不宜继续治疗者;治疗期间同时服用西药安眠药物者;病历记录或处方记录收集不全的患者;对中药成分过敏者。凡符合上述任何1条的患者,均予排除。

1.5数据处理

以《中华人民共和国药典》[6]、《中药学》[7]作为参考对象,将中药名称进行规范化、统一化处理,如“醋青皮”改为“青皮”,“麸炒白术”改为“炒白术”,“诃子肉”改为“诃子”等。

1.6数据录入及分析

将筛选后的200例不寐患者的性别、年龄、诊断证型以及治疗处方逐一录入平台,建立数据库并对数据库内的中药进行频次、四气五味、归经、关联规则、组方规律等分析,最后利用“嫡聚类”得到核心药队。

1.7潜在新方的网络药理学研究

1.7.1潜在新方药物活性成分的筛选和靶点预测

由于姚娓教授临床多以口服汤药作为内科治疗的手段,而中药的口服制剂饮入人体后必然要经历吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)、排泄(excretion)的过程(简称ADME),才能与靶器官以及靶组织结合从而发挥药效。因此,应用TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php),筛选最能体现姚娓教授治疗思路的潜在新方“木香”“佛手”“白术”“广藿香”“青皮”“诃子”“五味子”“厚朴”分别作为关键词进行检索。在检索时以口服生物利用度(oralbiavailability,OB)≥30%和类药性(druglikeness,DL)≥0.18作为筛选条件,得到该潜在新方的化学成分。接着使用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/),复核每个靶点所对应的标准化基因名称,限定物种为“HomoSapiens”,获得该潜在新方的活性成分对应的作用靶点合集。

1.7.2失眠相关靶点检索

在OMIM数据库(https://www.omim.org)和Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/)中,以“insomnia”作为关键词进行检索,剔除重复基因,得到失眠相关靶点。

1.7.3潜在新方与失眠靶点取交集

将该潜在新方的药物有效成分作用靶点与失眠病治疗靶点取交集,得到二者的交集靶点,并利用R4.0.2软件绘制韦恩图。

1.7.4构建靶点蛋白互作分析

将前一个步骤筛选出的交集靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/),研究物种选择“HomoSapiens”,然后进行蛋白互作分析,得到蛋白互作网络图。

1.7.5 GO及KEGG代谢通路分析

运用R4.0.2软件进行基因本体(geneontology,GO)功能富集分析和基于京都基因与基因百科全书(Kyoto EncyclopediaofGenesandGenome,KEGG)的KEGG代谢通路分析,分析潜在新方的中药分子生物过程及信号通路,并将GO和KEGG分析得出的结果以柱状图形式进行可视化展示。

2、结果

2.1患者年龄、性别频次

根据筛选出的信息,对200例病例进行分析,其中男性66例占33.0%,女性134例占67.0%,男女比例约为1:2。年龄最小为14岁,最大为86岁,以41～60岁人群最多,有76例,占全部病例的38%。

2.2中医证型频次

按姚娓教授临床经验将不寐病分为7个证型,详见表1。出现频率较高的是心脾两虚证、肝胃不和证、肝火扰心证。

表1姚娓诊疗不寐的证候分型 

2.3药物使用情况

2.3.1药物四气、五味、归经频次

四气中温性药物频次最高,其次是寒、平;五味频次最高的是辛,其次是苦、甘;归经以脾、胃、心、肝、肺、肾为主。详见图1。

图1姚娓治疗不寐的高频药物四气、五味、归经图  

2.3.2药物使用频次

200个处方涉及中药168味,使用频次≥20的共40味。其中排名前10位的中药分别为炙甘草、茯苓、半夏、党参、陈皮、桂枝、枳实、炮姜、柴胡、当归。用药频次按由高到低进行排序,详见表2。

表2姚娓治疗不寐的高频药物(频次≥20)  

2.3.3高频药物种类频次

将高频药物(频次≥40)按功效分类进行统计,补虚、理气、安神药出现频次较高。详见表3。

表3姚娓治疗不寐的高频药物功效分类

2.3.4药物组合频次及关联规则

将支持度设为75,置信度设为0.9进行筛选,得到药物组合共49个,详见表4。关联规则网络展示图见图2。当支持度为95,置信度为0.9时,网络展示图见图3。

表4姚娓治疗不寐的支持度≥75的药物组合 

图2姚娓治疗不寐的药物组方规律网络展示图(支持度75)

图3姚娓治疗不寐的药物组方规律网络展示图(支持度95)   

2.3.5潜在新方提取

相关度设为8,惩罚度设为2,得到24个药队,进一步提取生成姚娓教授治疗不寐的12个潜在新方,详见表5。

表5姚娓治疗不寐的潜在新方  

2.4明确最佳潜在新方

潜在新方(表5)各有侧重,“木香＿佛手＿白术＿藿香＿青皮＿五味子＿诃子＿厚朴”,为候选方中顾及最全面的一个方子,既有芳香化湿、收敛固涩、行气健脾之品,又有疏肝解郁、调畅三焦气机之品,用法精良,配伍得当,通过君臣佐使的巧妙配合,充分体现了姚娓教授用药的灵活性和延展性,故以此方为研究对象进行作用机制分析。

2.5潜在新方的有效成分、靶点以及失眠靶点筛选及获取

应用TCMSP数据库,设置生物利用度OB>30%及类药性DL>0.18,去重标准化后筛选出44个有效活性成分,见表6,219个潜在基因靶点,在OMIM、Gene Cards在线数据库中筛选出2590个失眠相关靶点,二者取交集得到104个潜在新方治疗失眠的潜在靶点,见图4。  

表6潜在新方药物活性成分表  

2.6构建有效成分-靶点-疾病调控图及蛋白互作网络图

运用Cytoscape3.7.2软件,构建成分-靶点-疾病网络图,见图5,其中环氧合酶(Prostaglandinendoperoxidesynthase,PTGS)1与20个活性成分均有交集,推测可能为潜在新方治疗失眠的关键靶点;构建蛋白互作网络图,见图6,白介素(Interleukin,IL)-6、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(proteinkinasesB,PKB,又称AKT1)、肿瘤坏死因子(TumorNecrosisFactor,TNF)、IL-1β等可能为潜在新方治疗失眠的主要靶点。

图4潜在新方作用靶点与失眠病作用靶点韦恩图

图5潜在新方药物成分-靶点-疾病调控图  

图6潜在新方药物关键靶点蛋白互作网络图  

2.7 GO功能富集结果

运用R软件对104个潜在靶点进行GO功能富集分析(P<0.05),共得到139个条目,将P值按由小到大的顺序排列,选取前20个条目进行可视化分析,形成GO功能富集分析柱状图,见图7,条目越长代表富集到该GO条目上的基因数量越多,颜色越红代表P值越显著。

图7潜在新方治疗不寐病关键靶点GO柱状图  

2.8 KEGG信号通路富集结果

对靶蛋白进行KEGG信号通路分析,共得到与不寐病密切相关的信号通路149条(P<0.05)。按P值由小到大排列,取前20位通路并绘制柱状图,详见图8。

图8 KEGG通路富集柱状图 

3、讨论

3.1姚娓对不寐病因病机的认识及对常用药性味归经、类别属性的分析

本研究200例患者年龄峰值在41～60岁之间,以中年为主,男女比例约1:2,与当前研究及流行病调查结果相符[8]。从证型分布可知以心脾两虚证、肝胃不和证、肝火扰心证多见,可能与现代人压力大,饥饱失常、熬夜等相关,因此脾虚与肝郁为常见患病因素,姚娓教授认为不寐致因在郁、病位在肝、脾。药物归经主在脾、胃、心、肝,性以温、寒为主,味以辛、苦、甘为主,体现了处方中“甘淡平补”的思想,虽药性中温、寒均占比较大,但论其病机不论是肝郁脾虚、肝胃不和还是肝火扰心,均与火热之邪扰乱心神有关[9],故姚娓教授治疗不寐病注意温凉适度,以“调补中焦”为主,是使人体阴阳气血得以调和。

从药物功效看,补脾、健脾、理气、安神药物较多,常用药物为炙甘草、茯苓、半夏、党参、陈皮等。炙甘草有滋阴养血、益气通阳、调和诸药的作用,茯苓有利水渗湿、健脾宁心之效,半夏有燥湿化痰、降逆之效,因其可通足阳明经又有降逆之效,故半夏还有降阳明的作用,吴鞠通也有言“半夏一两可降逆,二两可安眠”,且现代药理学研究也发现了半夏提取物具有镇静、催眠作用[10]。党参有补中益气、生津止渴、健脾益肺的功效;陈皮可理气开胃、下逆气、行滞气、舒肝气,与党参合用既可补气又可行气,使气补而不滞。体现了姚娓教授治疗不寐“调补、适温、重理脾气、养心、疏肝”的调补原则。

3.2姚娓治疗不寐核心处方分析及学术思想提炼

炙甘草、茯苓、半夏、党参、炒枳实、陈皮这几味药物联系较为密切,无论是对药、角药、四味药组还是五味药组,这些药物之间均互有联系。支持度75时,核心药组类似六君子汤与小柴胡汤的合方;当支持度95时,核心药组与“六君子汤”相似。六君子汤有健脾益气、和中化痰之效,其基本病机是脾气虚弱,湿聚成痰。小柴胡汤主治伤寒少阳病证,病机为邪在少阳,经气不利,郁而化热,治疗以和解少阳为主。少阳经病证主要为三焦以及胆经的病证,因此小柴胡汤除了有和解肝胆气郁的作用外还有调畅三焦气机的关键作用。姚娓教授不仅重视当代人普遍存在的脾虚本象,着重益气健脾除湿,还注重肝郁、肝火等“标实”之症并找到了治疗“标实”的根本大法———调畅三焦气机,以此改善患者的情绪(不寐导致的焦虑状态)和气机的运行。心主神明,肝藏魂,二者五行母子相及,两经相通,故应心肝同治。方中炙甘草、茯苓皆归心经,有定悸、安神、宁心之功。

综上所述,姚娓教授治疗不寐的学术思想有三:重视调畅三焦气机;重在调脾之本,心肝同治;随证加减,用药灵活。

3.3姚娓治疗不寐潜在新方的网络药理学结果分析

明确“重视三焦气机,调脾之本,心肝同治”的学术思想后,确定“木香-佛手-白术-藿香-青皮-五味子-诃子-厚朴”为研究对象,通过构建成分-靶点-疾病网络图、蛋白互作网络分析,推测PTGS1、IL-6、AKT1、TNF、IL-1β等为关键靶点。

PTGS1是化学药佐匹克隆治疗失眠的作用目标酶之一,由此推断其可能是潜在新方改善睡眠的靶点目标[11]。PTGS1也是存在于中枢神经系统皮层以及海马神经元处的一种重要的炎性反应介质[12,13],睡眠不足与炎症、疲劳、日间过度嗜睡、代谢综合征以及心血管疾病等有关,而这些病理症状和内源性促炎细胞因子水平的升高也有着十分密切的关系[14]。由此可知PTGS1是通过介导炎性反应来参与睡眠调节。IL-6是重要的炎症因子,IL-1β与IL-6同属于白细胞介素家族,它们与炎症反应密切相关,目前已知参与睡眠调节的细胞因子有IL-6、TNF等,TNF-α是炎性反应中最重要的炎症介质之一。任重阳等[15]观察发现,慢性失眠患者外周血中IL-1B、IL-6、TNF-α水平均较高,且当患者失眠程度越严重时IL-1B、IL-6、TNF-α的表达就越高。由此可见,这些靶点可能是潜在新方治疗不寐的关键靶点。

GO功能富集分析结果表明潜在新方的主要活性成分靶点是通过影响G蛋白偶联胺受体活性(GO:0008227)、儿茶酚胺结合(GO:1901338)、神经递质受体活性(GO:0030594)、细胞因子受体结合(GO:0005126)、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(GO:0061629)等功能对不寐病进行调控。KEGG信号通路的富集分析显示,潜在新方对治疗不寐的相关关键作用靶点主要富集于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等信号通路,其中富集较多且显著性最强的AGE-RAGE信号通路除了与糖尿病的发生有关外,还与神经系统疾病、消化系统疾病、肿瘤的产生有一定的关联。王姗姗等[16]发现糖尿病患者存在睡眠障碍时体内AGE水平升高,且AGE水平与睡眠障碍程度呈正相关。AGE-RAGE信号通路还可以激活核因子-κB通路,诱导相关促炎因子产生,而核因子-κB通路和IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等多条通路均与炎症反应有密切关系,而作为重要炎症介质的TNF-α与炎症因子IL-6、IL-1β等靶点均参与睡眠的调节。

上述结果表明,潜在新方“异病同治”治疗不寐的作用机制,可能是由所含槲皮素、柚皮素、豆甾醇、川陈皮素、鸢尾素等活性成分,通过影响PTGS1、IL-6、AKT1、TNF、IL-1β等靶点,来调控AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等实现的。这些靶点与通路之间相互涉及,可能为潜在新方治疗失眠的众多途径与研究线索之一,有待继续深度研讨。

参考文献:

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[2]刁雅静,钟华,相宏杰,等.从“阳不入阴”论治失眠[J].中医学报,2021,36(5):948-951.

[3]庄耀隆,姚霏,侯文跃,等.基于网络药理学和细胞实验验证黄芪抗肝癌的作用机制[J].世界中医药,2023,18(23):3311-3316.

[4]中华医学会精神科分会.中国精神障碍分类及诊断标准(CCDM-3)[M].济南:山东科学技术出版社,2004:68.

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[9]张进军,张莉,张士福,等.基于数据挖掘探讨徐经世膏方调治不寐病的用药规律[J].中国中医基础医学杂志,2022,28(3):458-462.

[10]马艳苗,张育敏,梁琦,等.基于象思维的半夏､夏枯草治疗失眠的研究[J].辽宁中医杂志,2018,45(3):503-504.

基金资助:第五批全国中医临床优秀人才研修项目(国中医药人教函[2022]1号);辽宁省优秀中医临床人才培养项目(辽卫办发[2021]29号);大连医科大学附属第二医院院内培育项目(dy2yynpy202218);

文章来源:鞠文雪,姚娓.姚娓治疗不寐的经验总结及潜在新方作用机制研究[J].中国中医基础医学杂志,2024,30(05):857-864.