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四川省2019-2022年环境污水脊髓灰质炎病毒监测

2024-06-29 325 上传者：管理员

摘要：目的评估四川省环境污水脊髓灰质炎(脊灰)病毒现状和传播风险。方法 2019年8月-2022年12月在四川省6个监测点采集环境污水样本，进行脊灰病毒分离和鉴定。结果共采集环境污水样本90份，分离到脊灰病毒105株、非脊灰肠道病毒160株。所有脊灰病毒分离株均鉴定为脊灰疫苗相似株，其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅰ+Ⅲ型PV分别占18.10%(19株)、0.00%(0株)、81株(77.14%)、5株(4.76%)。结论监测地区环境污水未发现脊灰野病毒或疫苗衍生脊灰病毒，监测结果为四川省继续维持无脊灰状态提供了补充证据。

关键词：
小核糖核酸病毒
环境污水
监测
肠道病毒
脊灰病毒
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脊髓灰质炎(脊灰)病毒(Poliovirus, PV)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，有三个血清型，经粪-口途径传播，人是PV唯一天然宿主，PV感染宿主后大部分为隐性感染，只有少部分感染者引起肢体麻痹，甚至造成终身残疾等严重后果[1]。PV感染易感者后，通常持续几周随着感染者的粪便被排出体外[2]。由于PV等肠道病毒(Enterovirus, EV)在外环境中有很强的生存能力，大量排到环境中的病毒依不同的环境条件而存活一定时间，并保持感染性[3],因此开展PV环境监测是急性弛缓性麻痹(Acute flaccid paralysis, AFP)病例监测的重要补充[4,5],为维持无脊灰状态提供更多依据[6]。目前在中国边境省份和部分内陆省份已开展环境污水EV分子流行病学监测，以了解PV和其他EV在环境中分布情况。2019年5月中国四川省凉山州雷波县发生了循环的Ⅱ型疫苗衍生脊灰病毒(Circulating vaccine-derived poliovirus, cVDPV)疫情，是自2016年5月1日脊灰疫苗接种程序转换以来首次在AFP病例中发现的Ⅱ型VDPV[7,8]。中国疾病预防控制中心(Center for disease control and prevention, CDC)、四川省CDC和相关地方CDC共同进行了调查和响应，在1例AFP病例、2例密切接触者和1例健康儿童粪便样本中检测到Ⅱ型VDPV[7]。环境污水PV监测可以快速、准确评估疫情蔓延情况。因此，本研究于2019年8月-2022年12月在该地区开展了三轮环境污水PV监测，以分析该地区外环境是否存在Ⅱ型VDPV,及时发现可能传播风险，进一步加强脊灰监测工作。

1、材料与方法

1监测点选择和样本采集

根据2019年四川省凉山州雷波县Ⅱ型cVDPV疫情情况、四川省各地区人口和既往Ⅱ型VDPV发生情况选择环境污水样本采集地区，在采集地区选择污水年处理量大的污水处理厂或生活污水集中排放处为采样地点，由采样地区CDC专业人员于2019年8月-2020年1月、2020年1-6月和2022年7-12月在不同地区开展三轮环境污水样本采集，每轮每月采集1次，第一轮和第二轮每次采集2份(每份2 L,间隔10 min以上),第三轮每次采集1份(每份2 L),污水样本送至四川省CDC进行PV和其他EV检测。第一轮采样地区和地点选择患儿居住地凉山州雷波县的生活污水集中排放处、患儿就诊地宜宾市的污水处理厂、人口较多的成都市的污水处理厂和2012年曾经发生Ⅱ型cVDPV疫情的阿坝州的马尔康市污水处理厂；第二轮采样地区和地点根据第一轮监测情况选择与雷波县相邻的凉山州金阳县和昭觉县的污水处理厂；第三轮采样地区和地点根据第一轮和第二轮监测情况选择成都市、凉山州雷波县和凉山州金阳县的相同采样地点。

2实验室检测

2.1样本过滤、浓缩和洗脱

环境污水样本的过滤和洗脱按照中国CDC病毒病预防控制所国家脊灰实验室《病毒环境监测技术培训班操作手册》2018年第6版的操作规程进行[9]。实验前对过滤装置、剪刀、镊子等进行高压灭菌处理。取1 L污水样本，倒入250 mL离心管中，于3 000 rpm、4℃条件下离心30 min。将上清液转入到烧杯中，加入2.5 mol/L的MgCl2(终浓度0.05 mol/L),用0.5当量浓度的HCl调节pH值至3.5。将硝酸纤维素滤膜和滤纸装入过滤装置，连接蠕动泵，过滤污水。待过滤结束后，在生物安全柜中拆开过滤装置，取出硝酸纤维素滤膜放到无菌平皿中，用无菌剪刀和无菌镊子将滤膜剪碎，放入50 mL离心管中。向离心管中加入10 mL的3%牛肉浸出液，加入玻璃珠，在振荡器上以480 rpm振荡30 min,然后于3 000 rpm、4℃条件下离心30 min,收集上清液(第一次洗脱液),再次加入10 mL的3%牛肉浸出液，30 min后于3 000 rpm、4℃条件下离心30 min,收集上清液(第二次洗脱液),用0.22μm针式滤器将两次洗脱液过滤除菌，进行后续实验。

2.2 PV分离和鉴定

PV分离所用的人横纹肌肉瘤细胞(Human rhabdomyosarcoma, RD)和转人脊灰受体的小鼠肺细胞系(Mouse cell line expressing the gene for the human cellular receptor for poliovirus, L20B)由中国CDC病毒病预防控制所国家脊灰实验室提供，PV分离和鉴定的操作程序按照世界卫生组织(World Health Organization, WHO)《脊灰实验室操作手册》第4版的标准操作规程和补充资料进行[10,11]。每份污水样本在每种细胞的24孔板上接种8孔(第一次和第二次洗脱液分别接种5孔和3孔)。观察致细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE),收获阳性分离物并进行型内鉴定[12,13]。鉴定后的疑似脊灰野病毒(Wild poliovirus, WPV)株和疑似VDPV株送至国家脊灰实验室进行序列分析，根据VP1编码区核苷酸序列变异数进行最终结果判定[14,15]。型内鉴定使用WHO下发的Poliovirus rRT-PCR ITD 5.1 kit试剂盒、Poliovirus rRT-PCR VDPV 5.0 kit试剂盒和商品化试剂GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System试剂盒。

3统计分析

采用WPS Office软件建立2019-2022年四川省环境污水PV监测数据库，采用SPSS 20.0软件统计分析EV、PV和非脊灰肠道病毒(Non-polio enterovirus, NPEV)分离阳性率等指标。

2、结果

1 PV和NPEV分离

1.1总体情况

2019年8月-2022年12月三轮环境污水监测6个监测点共采集环境污水样本90份，EV分离阳性率为68.89%(62份),其中28份样本同时分离到PV和NPEV,13份样本仅分离到PV,21份样本仅分离到NPEV,PV、NPEV分离阳性率分别为45.56%(41份)、54.44%(49份);在所有污水样本中共分离出265株EV,其中PV、NPEV分别为105株、160株(表1)。除凉山州昭觉县未分离到病毒外，其余各地区EV、PV、NPEV分离阳性率分别在25.00%-100%、16.67%-77.78%、25.00%-94.44%之间(Fisher精确概率法检验，P均<0.01)。

1.2 PV分离株血清型

在105株PV分离株中，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅰ+Ⅲ型PV分别占18.10%(19株)、0.00%(0株)、77.14%(81株)、4.76%(5株)(表2)。

1.3各轮监测中EV分离株数

第一轮监测共采集48份污水样本，分离出103株EV,其中PV、NPEV分别为46株、57株，在PV分离株中，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅰ+Ⅲ型分别为7株、0株、37株、2株；第二轮监测共采集24份污水样本，分离出90株EV,其中PV、NPEV分别为31株、59株，在PV分离株中，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅰ+Ⅲ型分别为2株、0株、29株、0株；第三轮监测共采集18份污水样本，分离出72株EV,其中PV、NPEV分别为28株、44株，在PV分离株中，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅰ+Ⅲ型分别为10株、0株、15株、3株(表3)。

表1四川省2019-2022年监测地区环境污水样本EV、PV和NPEV分离阳性率和毒株数

表2四川省2019-2022年监测地区环境污水样本PV分离株血清型构成

表3四川省2019-2022年监测地区各轮环境污水样本EV、PV和NPEV分离株数

2 PV鉴定

在105株PV分离株中，经型内鉴定，103株为脊灰疫苗相似株，2株为疑似VDPV株(2019年9月成都市1株Ⅲ型PV、2019年9月凉山州雷波县1株Ⅲ型PV);经国家脊灰实验室进行VP1区核苷酸序列分析，2株疑似VDPV株均存在4个核苷酸变异，判定为Ⅲ型脊灰疫苗相似株，排除VDPV。

3、讨论

2015年WHO宣布Ⅱ型WPV已在全球范围内被消灭。2016年4月WHO要求全球范围内同步停用含Ⅱ型PV成分的脊灰减毒活疫苗(Oral attenuated poliovirus vaccine, OPV)。中国按照WHO的决议于2016年5月1日实施新的脊灰疫苗免疫程序，停用三价脊灰减毒活疫苗(Trivalent OPV, tOPV),转换成接种1剂次三价脊灰灭活疫苗(Inactivated poliovirus vaccine, IPV)和3剂次含Ⅰ型和Ⅲ型PV成分的双价OPV(Bivalent OPV, bOPV),并将IPV纳入国家免疫规划。在任何来源的任何样本中检测到任何Ⅱ型PV包括WPV、VDPV和Sabin株通常被认为是全球公共卫生紧急情况[16]。2019年5月中国四川省凉山州雷波县发现Ⅱ型cVDPV,并推测其循环时间已达3年[7]。不同地点和时间的环境污水样本监测可以有效地了解Ⅱ型VDPV在环境中的循环状况和分布范围，起到提前预警和采取措施进行疫情控制和预防的作用，对阻断PV传播和维持无脊灰状态十分重要。

本次监测结果显示，从环境污水样本中分离的105株PV均为脊灰疫苗相似株，其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅰ+Ⅲ型PV分别占18.10%、0.00%、77.14%和4.76%,Ⅲ型脊灰疫苗相似株明显多于Ⅰ型脊灰疫苗相似株，与北京市、山东省和黑龙江省[17,18,19]的监测结果相似；未在环境污水样本中分离到WPV和Ⅱ型PV。

四川省凉山州雷波县发生Ⅱ型cVDPV事件后，除了开展环境污水PV监测外，还在凉山州开展了两轮针对2月龄至5岁儿童的IPV应急接种工作，在凉山州周边的甘孜州、宜宾市、阿坝州等地区开展了IPV查漏补种工作，同时加强AFP病例监测，开展了高质量的脊灰疫苗接种率调查[7]。本次环境污水监测未再发现Ⅱ型VDPV,可能由于采取的各种措施已经有效阻断了Ⅱ型VDPV的进一步传播。

在本次环境污水监测中还分离到160株NPEV。EV可以引起多种疾病，例如手足口病、无菌性脑膜炎、脑炎、心肌炎、急性出血性结膜炎、疱疹性咽峡炎等，近年来已成为备受关注的研究领域。通过对环境污水或监测目标人群中EV的病原谱进行分析，可在相关疾病暴发前起到疾病预警预测的作用[20]。

本次环境污水监测显示，成都市、凉山州雷波县和凉山州金阳县的环境污水样本中EV分离毒株共有239株，占所有分离毒株的90.19%。成都市因覆盖人口多而分离到的EV毒株数较多；而凉山州雷波县和凉山州金阳县为四川省免疫薄弱地区，且当地农村人居环境、水环境和农村厕所或粪便管理较差，而EV主要经粪-口途径传播，导致这两个地区EV分离毒株多。

本研究三轮环境污水监测均只开展6个月且不连续，未能在固定的监测地区进行连续采样，今后应开展长期、连续的环境污水监测，以全面反映监测地区环境中PV或NPEV流行、变异和循环状况。

综上所述，本次环境污水监测中没有发现WPV或VDPV,说明2019年发现的Ⅱ型cVDPV已被有效阻断，进一步传播风险较低，为四川省继续维持无脊灰状态提供了补充证据。长期系统的环境污水PV和NPEV监测可作为AFP病例监测的重要补充，并对人群中EV相关疾病流行的预测预警起着重要作用，将传染病疫情应对关口前移，有助于指导脊灰等疾病控制和预防工作的开展。

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文章来源:马小珍,祝双利,王成,等.四川省2019-2022年环境污水脊髓灰质炎病毒监测[J].中国疫苗和免疫,2024,30(03):293-297.