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同源盒基因2在大鼠慢性肾衰竭致血管钙化进程中的作用机制

2021-09-16 78 上传者：管理员

摘要：目的建立慢性肾衰竭(CRF)血管钙化大鼠模型,探讨同源盒基因2(Msx2)在此进程中的作用机制。方法将30只大鼠随机分为正常对照组、腺嘌呤灌胃组和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组,每组10只。所有大鼠以标准饲料喂养1周后,腺嘌呤灌胃组及高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠每日以腺嘌呤250mg/kg灌胃,正常对照组大鼠采用等量蒸馏水灌胃,均持续6周。腺嘌呤灌胃组和正常对照组大鼠期间以标准饲料喂养,高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠予以高磷饮食喂养。6周后处死所有大鼠,检测血钙、血磷、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平。取大鼠肾脏行苏木素-伊红(HE)染色,计算3组大鼠肾小管间质损伤指数(TIL)评分。取大鼠胸主动脉行HE染色及VonKossa染色,观察并进行钙盐沉积分级。采用免疫组织化学SP法检测Msx2在主动脉中的表达水平。采用Pearson相关分析探讨影响Msx2表达的相关因素。结果腺嘌呤灌胃组和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠血磷、SCr、BUN水平、TIL评分、Msx2表达水平均明显高于正常对照组,高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠血磷、Msx2表达水平均高于腺嘌呤灌胃组(P<0.01)。VonKossa染色结果显示,正常对照组大鼠胸主动脉钙盐沉积分级为0级,腺嘌呤灌胃组钙盐沉积为2～3级,高磷饮食+腺嘌呤灌胃组为3～4级。Pearson相关分析结果显示,腺嘌呤灌胃组及高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠血磷(r=0.882)、钙盐沉积分级(r=0.858)与Msx-2的表达水平均呈正相关(P<0.01)。结论腺嘌呤灌胃联合高磷饮食法可成功建立CRF血管钙化的大鼠模型且Msx2参与其病变的发生、发展过程,其中高磷血症可能增加Msx2的表达水平。

关键词：
同源盒基因2
慢性肾衰竭
腺嘌呤
血管钙化
高磷饮食
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心血管疾病(CVD)是慢性肾衰竭(CRF)患者的主要并发症和首位死亡原因[1]。而慢性肾脏病患者并发心血管疾病大多与血管钙化有关，故对CRF伴血管钙化机制的研究在临床上极为重要。其中建立类似人类CRF血管钙化病理变化的理想动物模型是研究的前提。CRF患者的血管钙化是一种类似于骨和软骨形成的转化过程[2]，而血管平滑肌细胞(VSMC)表达成骨细胞表型是该过程的中心环节[3,4]。骨形成蛋白(BMP)-2是骨细胞表型中重要成员之一，其下游骨转录因子同源盒基因2(Msx2)也起到重要作用。既往国外仅有体外实验研究显示Msx2参与动脉钙化病变过程，故本实验采用高磷饮食联合腺嘌呤灌胃的方法制备新的CRF血管钙化大鼠模型，探讨Msx2在CRF血管钙化大鼠体内实验中的作用机制。

一、材料与方法

1．材料:12周龄成年雄性SD大鼠30只及大鼠饲料均购于第三军医大学大坪医院实验动物中心，大鼠平均体质量(200±20)g。腺嘌呤购于美国Amersco公司，VonKossa特殊染色试剂盒购于美国GenmedScientifics公司，核固红复染试剂购于博士德生物工程公司，二氨基联苯二胺(DAB)显色剂及增强型(Polink-1)免疫组化试剂盒(货号PV-6001)购于北京中山金桥公司，兔抗鼠同源盒基因Msx2(Hox8)多克隆抗体(货号bs-6232R)购于北京博奥森公司。

2．方法

(1)分组与造模方法:选择12周龄健康成年雄性SD大鼠，随机分为3组，即正常对照组、腺嘌呤灌胃组、高磷饮食+腺嘌呤灌胃组，每组10只。将腺嘌呤加蒸馏水配成浓度为2.5%混悬液，置于4℃冰箱备用。所有大鼠以标准饲料喂养1周后，腺嘌呤灌胃组及高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠每日以腺嘌呤250mg/kg灌胃，正常对照组采用等量蒸馏水灌胃，均持续6周。腺嘌呤灌胃组和正常对照组大鼠期间以标准饲料喂养，高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠予以高磷饮食喂养。高磷饮食配方参考文献[6]，其中高磷饮食含磷约1.2%，普通饮食含磷约0.6%。

(2)标本采集:每日观察大鼠状态，并记录大鼠体质量、饮水量及尿量。于灌胃6周后将3组大鼠以3%戊巴比妥麻醉，心脏采血后予多聚甲醛心脏灌注致死，取出双侧肾脏及胸主动脉，肉眼观察后再将标本固定在多聚甲醛中24小时备用。

(3)生化指标检测:处死前于大鼠心脏采血3ml，离心后取血清，检测大鼠血钙、血磷、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平。

(4)肾脏组织病理学检查:将多聚甲醛中的大鼠肾脏组织进行苏木素-伊红(HE)染色，在光镜下观察并计算3组大鼠肾小管间质损伤指数(TIL)评分:每张标本低倍镜视野下随机选取10个肾小球间质视野，按照表1中各项观察项目评分，各项评分总和为一个视野的评分，该标本的肾小管间质TIL评分=10个视野评分的平均值[6]。

(5)胸主动脉病理学检查:将多聚甲醛中的大鼠胸主动脉组织常规脱水后进行石蜡包埋，再制成3μm切片，进行HE染色和VonKossa染色。VonKossa染色后观察并进行钙盐沉积分级:0级，无钙盐沉积;1级，点状沉积;2级，单个片状沉积;3级，多个片状沉积;4级，弥漫性沉积[7]。

(6)链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP)检测Msx2在主动脉中的表达水平:每张大鼠胸主动脉组织切片随机选取5个高倍视野(400倍)，镜下见棕黄色为阳性部位，使用Image-proPlus图像分析软件测定每个视野的阳性面积，取平均值。

3．统计学处理:应用SPSS22.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用方差分析。采用Pearson相关分析探讨影响Msx2表达的相关因素。以P<0.01为差异有统计学意义。

二、结果

1.3组大鼠一般情况:正常对照组大鼠造模6周后反应灵敏，皮毛整齐，饮食及大便均正常，体质量逐渐增长至(300±20)g。腺嘌呤灌胃组和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠自造模2～3周后开始出现精神萎靡，摄食量减少，体毛脱落，饮水量及尿量均明显增加;4～5周后开始出现反应迟钝、皮肤斑秃，摄食量、大便量及次数、尿量均减少;该两组大鼠自灌胃开始体质量均持续下降。造模过程中正常对照组10只全部存活，腺嘌呤灌胃组大鼠死亡3只，高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠死亡4只。

2.3组大鼠肾脏组织病理染色结果:肉眼观察下，正常对照组大鼠肾脏组织呈深红色、质软光滑。腺嘌呤灌胃组和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠肾脏呈米黄色，体积显著增大，类似“大白肾”，高度水肿、质脆，皮髓质分界不清。HE染色后镜下观察:正常对照组大鼠肾脏组织中肾小球、肾小管及肾间质结构形态正常;腺嘌呤灌胃组与高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠肾脏组织中局部肾小管明显萎缩或扩张、管腔内可见少量管型，上皮细胞出现空泡变性或坏死脱落，肾间质纤维化，大量炎性细胞浸润;肾小球结构破坏，少量纤维化，肾间质及小管内可见棕黑色结晶沉淀。见图1。

3.3组大鼠生化指标及TIL评分比较:腺嘌呤灌胃组和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠血磷、SCr、BUN水平及TIL评分明显高于正常对照组(P<0.01);高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠血磷水平高于腺嘌呤灌胃组(P<0.01)。3组大鼠血钙比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

4.3组大鼠胸主动脉组织病理染色结果:正常对照组大鼠胸主动脉HE染色结果显示胸主动脉弹力层完整、细胞排列整齐;腺嘌呤灌胃组和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠动脉血管正常结构破坏，平滑肌细胞增生，弹力层中层结构改变;其中高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠动脉平滑肌细胞增生更为明显，结构完全破坏。胸主动脉VonKossa染色结果显示，正常对照组大鼠胸主动脉组织染色呈粉红色，未见黑色钙盐沉积，钙盐沉积分级为0级;腺嘌呤灌胃组和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠胸主动脉组织中膜弹性纤维间可见黑色颗粒沉积于基质和细胞内，即钙沉积;其中高磷饮食+腺嘌呤灌胃组更为严重，可见黑色颗粒呈明显线条状弥漫性分布，故腺嘌呤灌胃组钙盐沉积为2～3级，高磷饮食+腺嘌呤灌胃组为3～4级。见图2。

5.3组大鼠胸主动脉平滑肌细胞中Msx2的表达水平比较:正常对照组大鼠主动脉中层血管平滑肌细胞中Msx2仅在胞浆中少量表达(86.60±12.79)，而腺嘌呤灌胃组(206.49±26.04)和高磷饮食+腺嘌呤灌胃组(336.74±38.92)大鼠平滑肌细胞胞浆及细胞外可见较多黄褐色物质沉积，深染率高，提示Msx2表达增多，明显高于正常对照组(P<0.01)。其中高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠血管平滑肌细胞可见黄色深染物质沉积并聚集成片，其深染率明显高于腺嘌呤灌胃组，提示Msx2表达水平高于腺嘌呤灌胃组(P<0.01)。见图3。

6．影响Msx2表达的相关分析:Pearson相关分析结果显示，腺嘌呤灌胃组及高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠血磷(r=0.882,P<0.01)、钙盐沉积分级(r=0.858,P<0.01)与Msx-2的表达水平均呈正相关。

三、讨论

目前国内成熟的CRF血管钙化造模方法主要包括肾次全切除加高磷饮食诱导[8]、肾大部切除联合维生素D3[9]及腺嘌呤灌胃[10]，其中肾次全切除方法操作复杂、易感染且死亡率高;而维生素D3方法会使钙盐沉积在弹力膜[9]，与尿毒症血管钙化表现不符，故均不作为首选方法。而腺嘌呤灌胃进入体内，在黄嘌呤氧化酶作用下转化为2,8-二羟基腺嘌呤，并沉积在肾小管，诱发肾功能衰竭，继而出现电解质紊乱，钙磷代谢异常，形成动脉钙化[11]。本实验在腺嘌呤基础上加入高磷饮食，结果证实高磷饮食联合腺嘌呤灌胃方法制作血管钙化模型效果更为显著，为临床CRF动脉钙化相关研究提供了一个新的快速可靠的造模方法

本实验中大鼠胸主动脉钙化病理结果基本与临床典型的尿毒症血管钙化表现相似，即类似骨发育的、主动的、可调控的动脉钙化过程，其表现为动脉中层钙化，且钙化部位周围可见骨基质样蛋白，内膜完整、结构正常。终末期肾衰竭患者的血管钙化也与尿毒症导致的高磷血症密切相关。本实验中高磷饮食+腺嘌呤灌胃组大鼠胸主动脉血管正常结构严重破坏，平滑肌细胞增生紊乱，VonKossa染色结果显示主动脉血管中膜组织间沉积了大量黑色颗粒，钙盐沉积为3～4级，均较腺嘌呤灌胃组严重，也提示高磷血症诱导并加重了CRF血管钙化程度。但其机制目前还尚未完全清楚，可能有以下3个方面:高磷可刺激血管平滑肌细胞(VSMC)中碱性磷酸酶(ALP)的表达，从而诱导并上调转录因子CBFα1[12]，促进成骨细胞表型及成骨相关性蛋白的表达，诱发细胞钙化;细胞内高磷导致部分细胞凋亡，而后转换为钙化结晶，既往文献研究表明凋亡小体可诱导VSMC钙化[13];细胞内高磷还可刺激碱性磷酸酶(ALP)和钙结合蛋白分泌[14]。

Wnt蛋白属于分泌型的糖基化蛋白，可在血管平滑肌细胞中表达，而骨转录因子Msx2可通过上调多种Wnt蛋白配基的表达从而增强Wnt/β蛋白信号通路[15]。此通路可分别促进和调节间质细胞、成肌纤维细胞向成骨细胞、成骨样细胞分化增殖[16]。Msx2在CRF大鼠的钙化血管内大量表达，且与动脉钙盐沉积分级呈正相关，表明其在CRF动脉钙化的整个进程中起重要作用。高磷饮食干预后血管内Msx2表达则明显增加，考虑其相关机制可能是由于高磷诱导并上调转录因子CBFα1，促进骨形成蛋白(BMP)的表达，继而上调其下游因子Msx2的表达，但具体的影响机制目前还尚未清楚，有待于进一步的实验研究探讨。

综上所述，腺嘌呤灌胃联合高磷饮食是较为合适的研究CRF血管钙化的造模方法。CRF血管钙化是一个类似成骨形成的过程，Msx2也参与了CRF血管钙化病变的发生、发展过程，而高磷血症会加重CRF血管钙化程度，其机制可能与骨转录因子Msx2的表达水平升高有关。

文章来源：徐莹,操轩.同源盒基因2在大鼠慢性肾衰竭致血管钙化进程中的作用机制[J].临床内科杂志,2021,38(09):623-627