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续断提取物对骨质疏松性大鼠信号通路作用的研究进展

2023-07-12 89 上传者：管理员

摘要：骨质疏松症(osteoporosis, OP)是骨吸收大于骨形成的骨代谢疾病，随着全球老龄化加重，严重威胁人类健康安全。续断作为传统补肾中药在防治OP方面具有广阔潜力，有关研究表明续断通过多靶点、多途径调控相关信号通路防治OP。最新药理学研究证明续断提取物木通皂苷D等成分可通过调控有关信号通路和促炎因子干预碱性磷酸酶、骨保护蛋白、骨钙素等蛋白因子表达，作用于成骨细胞、破骨细胞以及骨髓间充质干细胞有效防治OP。通过检索续断提取物防治OP的基础研究发现，续断提取物木通皂苷D、熊果酸、多糖类可以通过Wnt/β-catenin、MAPK、PI3K/AKT、BMP-Smads信号通路促骨形成，通过OPG/RANKL/RANK、雌激素信号通路抑制骨吸收防治OP。笔者就续断提取物调控不同信号通路，促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞分化，诱导骨髓间充质干细胞定向分化作一综述，为今后中医药防治OP的基础研究提供新思路。

关键词：
中医中药
木通皂苷D
续断
骨质疏松症
骨髓间充质干细胞
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骨质疏松症(osteoporosis, OP)是破骨细胞(osteoclasts, OC)介导的骨吸收与成骨细胞(osteoblasts, OB)介导的骨形成之间的偶联平衡被打破，致使骨丢失大于骨形成的异常骨代谢疾病[1],因OP造成的髋部骨折、胸腰椎压缩性骨折等疾病严重威胁着人类的健康，OP已成为全球共同面临的社会、医疗、经济问题[2,3]。现阶段对OP的治疗主要以西药为主，但其高费用和严重胃肠道反应等问题而使患者依存性较差，临床疗效折扣[4]。故开发低毒性、价格低廉的药物治疗OP成为一大研究热点。

随着中药药理学研究不断深入，研究发现[5]续断提取物在促进骨折和肌腱愈合时，降低炎症因子水平，上调骨形成基因表达。然而临床治疗上，续断往往是以复方形式存在，鲜有以单味中药或活性单体形式治疗OP,因此本研究查阅国内外相关文献，就续断提取物诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)成骨分化、促进OB增殖分化，抑制OC分化防治OP的相关信号通路研究着重综述，为OP的基础研究和临床应用提供一些帮助。

1、续断提取物

续断，川续断科植物川续断Dipsacus asper Wall.Ex Henry的干燥根。其性微温，味苦、微甜而后涩，归肝肾经，强筋骨、止崩漏、调血脉，主腰背肢节痿痹[6]。研究表明[5],续断成分包含三萜皂苷类、环烯醚萜类、酚醛酸类、生物碱、挥发油类、多糖类、呋喃木脂素及镁、锌、铜等微量元素。近年来，续断及提取物防治OP得到广泛关注，其中抗OP的活性成分主要是川续断皂苷Ⅵ、熊果酸和酚醛酸类[7,8]。续断皂苷Ⅵ又被称为木通皂苷D(akebia saponin D,ASD),研究发现[9,10],ASD可上调Runt相关转录因子2 (runt-related transcription factor 2,Runx2)表达，提高碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性，促进骨保护蛋白(osteoprotegerin, OPG)和骨钙素(osteocalcin, OCN)相关RNA表达，诱导大鼠BMSCs成骨分化和OB矿化。熊果酸通过抑制核因子κB受体激活因子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)诱导的抗酒石酸酸性磷酸酶活性和多核破骨细胞形成，显示出强大的抗OP作用[11]。酚醛酸类在OP性压缩骨折恢复中，能提高Ⅰ型前胶原表达，加速骨结痂，促进骨不连愈合[12]。

2、毒副作用

整理文献，大多数学者对续断提取物药理作用的研究主要在抗炎、抗氧化，保护心肌细胞、保护神经元，促进骨愈合等方面[13],毒副作用研究较少。Xiao等[14]利用怀孕小鼠评估ASD毒性，中等剂量组[8 g/(kg·d)]和高剂量组[32 g/(kg·d)]小鼠的体重显著低于安慰剂组，同时，低剂量组[2 g/(kg·d)]、中剂量组和高剂量组的畸胎率呈剂量依赖性增加。Song等[15]发现续断皂苷C是促凝血的关键成分，通过消耗细胞内钙离子和三磷酸腺苷，产生磷脂酰丝氨酸后激活血小板形成血栓，同时，续断皂苷C破坏线粒体膜电位，释放细胞色素C,通过氧化应激破坏细胞功能。此外，高浓度(10-4 g/mL)的ASD对OB增殖产生抑制作用[16]。因此，合理开发利用续断，研究毒理作用，向有益于人类健康的方向发展仍是未来科研重任。

3、续断提取物-骨质疏松症相关信号通路

近年来，在中药单体或复方调节BMSCs、OB、OC、免疫细胞等骨代谢相关细胞抗OP的研究中呈现出多途径、多靶点的特征[17]。其中续断提取物或其含药血清可激活Wnt、MAPK、PI3K/AKT等多条信号通路作用于BMSCs、OB和OC抗OP,以下对其进行阐述。

3.1促进骨形成相关信号通路

3.1.1续断提取物对Wnt/β-catenin信号通路调控研究：

Wnt受体激活有3种途径：Wnt/β-catenin途径、平面细胞极性途径和Wnt/Ca2+途径[18]。Wnt/β-catenin在维持骨骼内环境稳态及调节各类骨细胞增殖、分化中起重要作用。主要诱导OB分化，增强OB活性，促进OB产生骨基质并矿化，调节骨重建[19]。

研究发现ASD可诱导BMSCs成骨分化。张强等[20]用ASD给药12周，测OP大鼠骨密度，采用PCR实验和Western blotting检测β-catenin蛋白、低密度脂蛋白相关受体蛋白5(LPR5)、成骨转录因子(Osx)、Runx2以及Wnt通路拮抗剂硬化蛋白(SOST)。ASD治疗组骨密度显著增高，并且束骨髓比增高，同时，ASD治疗组股骨组织中β-catenin、LPR5蛋白的含量高于安慰剂组，Runx2和Osx明显增加，SOSTmRNA表达低于安慰剂组，表明ASD可以抑制SOST,使信号转导顺利进行。李家等[21]应用ASD诱导大鼠BMSCs成骨分化21 d后钙离子浓度增高，OCN、β-catenin、Runx2基因表达增强。因此，ASD激活Wnt/β-catenin信号通路诱导BMSCs成骨分化，主要是上调LPR5、β-catenin蛋白受体，下调抑制因子SOST,促进OCN、β-catenin、Runx2基因表达。

3.1.2续断提取物对MAPK信号通路调控研究：

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路属于丝氨酸-苏氨酸激酶的一大家族，参与细胞增殖、分化、转移和凋亡，是将外部信号传递到细胞核的信号通路[22]。MAPK有3个主要亚家族：细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated kinase, ERK1/2)、c-Jun N末端应激蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38 MAPK三种蛋白激酶。ERK1和ERK2主要在OB中表达；JNK信号通路共有JNK1/2/3三种亚型，负责磷酸化某些蛋白、在细胞S期延缓细胞凋亡，促进细胞增殖；p38 MAPK有p38α/β/γ/δ4种亚型，其作用是催化OB矿化且与哺乳类动物炎症反应息息相关[23,24]。

MAPK信号通路在ASD诱导BMSCs成骨分化中具有重要作用。张云辉等[9]研究发现ASD增加P38和ERK蛋白活性促进大鼠BMSCs向OB分化。黄媛等[25]研究得出ASD增加骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic proteins, BMP-2)合成，激活JNK信号通路，调节c-Jun的磷酸化，促使BMSCs向OB分化。ASD不仅通过MAPK信号通路诱导BMSCs向OB分化，还能激活P38、ERK1/2介导的前成骨细胞成熟和矿化[26]。因此，MAPK信号通路3个亚家族均可作用于BMSCs治疗OP。

3.1.3续断提取物对PI3K/AKT信号通路调控研究：

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3K)是独立的磷脂酰肌醇激酶家族，主要包括PI3KⅠ/Ⅱ/Ⅲ3个亚型，PI3KⅠ调节细胞的生长周期、代谢反应[27]。苏氨酸激酶(threonine kinase, AKT)也包含3个亚型：Akt1/2/3,能直接激活PI3K,通过磷酸化靶蛋白或抑制其下游靶点核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调节细胞信号[28]。最近研究发现[29]通过激活PI3K/AKT信号通路增加OPG表达，抑制BMSCs向OC分化。

ASD诱导BMSCs成骨分化与PI3K/AKT信号通路紧密相关。许勇等[30]用ASD对OP大鼠灌胃干预，第7天ALP活性增强，ALP、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)、Runx2对应的mRNA表达上调，PI3K、AKT蛋白表达水平显著升高,证明ASD可以促进BMSCs的增殖和成骨分化。Ke等[31]发现ASD激活PI3K/AKT信号通路不仅加速BMSCs增殖、成骨分化、矿化，还能阻断OB磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸3-磷酸酯在小鼠中的表达，抑制OC形成，降低骨吸收。由此可见，ASD通过PI3K/AKT信号通路促进成骨基因OPN、Runx2及P-AKT蛋白表达诱导BMSCs成骨分化治疗OP。

3.1.4续断提取物对BMP-Smads信号通路调控研究：

BMPs是转化生长因子β超家族的一员，在BMP亚家族成员中，BMP2与细胞膜上受体结合，激活ERK1/2、p38、c-Jun激酶和Smad1/5/8蛋白并磷酸化，之后进入细胞核，启动Runx2转录，在体内和体外诱导骨形成[32,33]。Smad蛋白家族是传递BMP-Smads信号的重要媒介。BMP2和细胞表面骨成型蛋白受体Ⅱ(BMPR-Ⅱ)结合，磷酸化BMPR-I的膜内区域，并与Smad4结合转移到细胞核，诱导下游BMPs基因的转录，上调Runx2,以调节细胞分化[34]。

研究报道[10],ASD激活BMP-Smads信号通路，增强Smad1/5蛋白磷酸化水平，上调OCN和Runx2表达，促进糖皮质激素环境下小鼠BMSCs成骨分化。ASD激活BMP-Smads信号通路还可以促进脂肪源干细胞成骨分化。Ding等[35]研究发现，ASD可阻断脂肪源干细胞中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-a)、白细胞介素(interleukin, IL)-6和IL-1b的释放，上调Smad2/3磷酸化水平，增强ALP、OCN活性。OCN作为骨细胞外基质中最丰富的糖蛋白，结合钙离子，调节BMSCs向OB分化并促进骨基质矿化[36]。但该研究发现[35],ASD对脂肪源干细胞增殖无影响。此外，续断多糖可通过激活BMP-Smads信号通路使BMP2和Runx2相关mRNA及蛋白质水平上调，促进OB增殖和分化[37]。由此可见，续断提取物诱导BMSCs成骨分化防治OP的实验研究中，不只有ASD,但续断其他提取物和OP相关性的研究较少，有待后续进一步探讨。

3.2抑制骨吸收相关信号通路

3.2.1续断提取物对OPG/RANKL/RANK信号通路调控研究：

OPG mRNA在脊髓和骨骼中表达，其生物学作用是抑制OC活性和分化；RANKL mRNA在骨髓和淋巴组织中的表达水平最高，其在骨中的作用一是刺激OC分化和抑制OC凋亡，二是激活T细胞中的JNK磷酸化，抑制树突状细胞凋亡[38]。RANK是RANKL的受体，RANK mRNA在分离的骨髓源性前破骨细胞和成熟的OC中高度表达[38]。研究证明[39]OPG能竞争性与RANKL结合抑制骨吸收或加速OC凋亡，因此，OPG/RANKL的比值决定是否诱发OP。

Chen等[40]研究发现ASD有助于BMSCs中OPG mRNA的表达并抑制RANKLmRNA表达，降低单核破骨细胞分化，通过OPG/RANKL/RANK信号通路，促进血管生成，防止骨小梁微结构恶化。ASD还能促进OB分泌OPG,与Chen等[40]研究一致，ASD调节OPG与RANKL的表达比率来促进成骨分化[41]。并且续断药理学研究证明[42],续断多糖也可激活OPG/RANKL/RANK信号通路诱导BMSCs成骨分化，且酒续断的调控能力强于生续断。由此可见，不同方法炮制的续断提取物药效并不一致，续断提取物可通过抑制OC防治OP,然而当前续断不同炮制法影响药效学的研究较少，仍需积极探索。

3.2.2续断提取物对雌激素信号通路调控研究：

绝经女性发生OP与雌激素水平下降显著相关。雌二醇通过雌激素受体(estrogen receptors, ERα/β)发挥效应，ERα可以改变OPG/RANKL比率以减少OC生成，ERβ可抑制IL-6生成而下调OC活性[43]。此外，学者发现续断提取物獐牙菜苷具有类雌激素作用，可上调膜ERα表达，促进OB分化和矿化。然而，续断主要成分ASD是否作用雌激素信号通路防治OP还需更多实验研究[44]。

4、小结与展望

OP是一种全身性骨骼疾病，其主要特征是骨密度和骨机械强度下降，导致髋部和脊柱脆性骨折率增加。中医药是中华民族伟大瑰宝，在中医理论指导下合理开发中药防治OP具有广阔的前景。随着细胞生物学技术发展，发现续断提取物通过多通路调控防治OP,本研究通过梳理续断成分及药理作用，总结阐述续断提取物从不同生物学信号通路调控骨代谢，从而起到抗OP作用(见图1)。从信号通路角度研究续断提取物抗OP主要分两个方面，一是促骨形成信号通路，如Wnt/β-catenin、MAPK、PI3K/AKT、BMP-Smads信号通路，并且通过Wnt/β-catenin、PI3K/AKT通路，续断主要成分ASD不仅可促进BMSCs增殖、定向分化，还可促其向OB分化和增殖。二是抑制骨吸收相关信号通路，如OPG/RANKL/RANK、雌激素信号通路，主要抑制OC分化及活性防治OP。

图1续断提取物抗OP信号通路图(本图由Figdraw绘制)

但是，续断防治OP仍有不足：(1)尚无续断单体成分研发的抗骨质疏松药物。(2)对ASD的研究多为动物实验，是否外推临床仍需多中心的循证依据。(3)续断有效成分繁多，除ASD外，其他成分药理作用仍需深入研究。(4)续断毒副作用研究尚少，毒理学机制仍不明确。(5)是否多条信号通路相互交叉、协同作用有待验证。综上，续断防治OP的物质基础及机制还需进一步研究，相信将来在多学科交叉融合下，定能造福人类。

参考文献:

[5]代琪,叶臻,叶俏波,等.续断来源考证､化学成分及药理作用综述[J].中国药物评价,2020,37(6):432-436.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2020:329-330

[9]张云辉,刘成成,祝爱珍,等.木通皂苷D通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞[J].中国病理生理杂志,2012,28(8):1455-1460.

[10]张志达,沈耿杨,任辉,等.木通皂苷D促进糖皮质激素环境下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化[J].中国骨质疏松杂志,2020,26(4):529-533.

基金资助:国家自然科学基金(81760877);甘肃省自然科学基金(22JR5RA640);

文章来源:金芳全,樊成虎,唐晓栋等.续断提取物对骨质疏松性大鼠信号通路作用的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2023,29(07):1016-1020.