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猪源多杀性巴氏杆菌荚膜血清PCR分型鉴定

2023-10-26 71 上传者：管理员

摘要：本研究旨在了解河南省长垣市猪源多杀性巴氏杆菌的流行情况,采集不同猪场127份疑似多杀性巴氏杆菌病的鼻咽拭子,应用细菌分离纯培养、生化反应试验、 16S rRNA PCR扩增和测序、荚膜血清分型和动物致病性试验对分离菌株进行鉴定。结果鉴定出10株多杀性巴氏杆菌,检出率为7.87%,其中1株为荚膜血清型基因B型(capB), 3株为荚膜血清型基因D型(capD), 6株为荚膜血清型基因A型(capA)。动物致病性试验结果显示,有34只小鼠在接种该菌后36 h内死亡,表明该分离菌致病力较强。长垣市多杀性巴氏杆菌的主要流行菌株为荚膜血清型A型和D型,本研究为猪多杀性巴氏杆菌病防治和疫苗的研发提供了基础依据。

关键词：
PCR
分离鉴定
多杀性巴氏杆菌
生猪
荚膜血清
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多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是巴氏杆菌科巴氏杆菌属成员，革兰氏染色阴性，球杆菌或短杆状菌，需氧或兼性厌氧，无鞭毛、无芽胞、无运动性，能够引起多种畜禽出血性败血症或传染性肺炎[1]。多杀性巴氏杆菌的血清型较多，根据其荚膜抗原差异，多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E、F等5种血清型[2]。不同血清型对宿主有不同的易感性，如多杀性巴氏杆菌血清型A和D型通常与猪的肺炎和胸膜炎有关，血清型B和E型菌株与牛出血性败血病有关[3,4]，此外多杀性巴氏杆菌血清型不同，其交叉免疫保护力较差，因此，对病原鉴定时有必要鉴定其血清型。

本研究对河南省长垣市部分养猪场发病猪采集鼻咽拭子进行多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定，并进行PCR荚膜血清型检测和分离株对抗菌药物耐药性的检测，以期为猪多杀性巴氏杆菌病防治和疫苗研发提供参考。

1、材料与方法

1.1 病料采集

采集长垣市部分养猪场疑似猪肺疫、猪萎缩性鼻炎病猪的鼻拭子127份，装入含有TSB液体的培养基收集管中，送实验室4℃保存备用。

1.2 试验材料和试验动物

胰酶大豆琼脂培养基（TSA，含有5%犊牛血清和5%脱纤维绵羊血）、酶大豆肉汤培养基（TSB）均购自天津一方科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq PCR Master Mix由Solarbio公司生产；抗生素药敏纸片，细菌生化反应鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司。5周龄SPF级小鼠55只，购自河南科技学院动物医学实验室。

1.3 细菌的分离培养

将127份病料分别接种于含有5%犊牛血清和5%脱纤维绵羊血TSA培养基中，37℃纯化培养24 h，然后挑取单个菌落制作涂片，对菌落分别进行革兰氏染色和瑞氏染色，油镜观察细菌染色和形态特性。

1.4 生化鉴定试验

挑取纯化的分离菌落，按照细菌生化鉴定说明书分别接种于蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、硝酸盐、枸橼酸盐、麦芽糖、V-P、M-R、硫化氢、蛋白胨水、甘露醇、H2S等细菌生化鉴定管中，37℃培养24 h，观察反应结果。

1.5 分离菌株16S r RNA鉴定

取纯化的分离菌株，接种于含有5%犊牛血清的TSB培养基中，摇床震荡，37℃培养24 h，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取分离菌株的基因组DNA。参考朱飞舟等[5]合成细菌16S r RNA通用引物，引物序列为：27F:5’-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3’,1492R:5’-ACGGCTACCTTGTTAC-GACTT-3’，由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。预期扩增目的片段1 450 bp。PCR反应体系20μL：分离菌株DNA模板2μL，上下游引物各0.5μL,2×Taq PCR Master Mix 12μL,dd H2O补足至20μL。PCR反应程序：94℃5 min,94℃30 s,53℃30 s,72℃60 s，共35个循环，72℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，获取的目的片段，经回收后送中美泰和生物技术（北京）有限公司进行分离菌株16S r RNA测序，测序结果与NCBI数据库收录的多杀性巴氏杆菌基因组序列进行BLAST同源性比对分析，以鉴别分离菌株种类。

1.6 荚膜血清型PCR鉴定

参照李红婕等[6]设计的荚膜血清型特异性引物cap A、cap B、cap D、cap E、cap F序列，分别合成引物，由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成。除所有鉴定引物退火温度均为55℃外，其他PCR反应体系和反应程序与上述1.5内容相同。引物生物信息见表1。

1.7 对小鼠的致病性试验

用无菌生理盐水稀释纯培养菌落，分光光度计测定菌液浓度，使其终浓度为1×108CFU/m L。将5周龄SPF昆明小鼠分成1个对照组和10个试验组，每组5只。试验组腹腔注射菌液0.2 m L/只，对照组注射等体积的生理盐水。观察小鼠精神状态，记录死亡时间和数量。采集死亡小鼠肝脏、肺脏、脾脏等组织器官，分离培养和革兰氏染色、瑞氏染色。

表1多杀性巴氏杆菌荚膜血清型鉴定引物生物信息

2、结果与分析

2.1 细菌染色镜检与分离鉴定

本研究共有10株分离菌在含有绵羊血和犊牛血清的TSA培养基上形成稍微隆起、表面光滑湿润、呈露珠状的灰白色圆形菌落（图1A）；镜检观察到分离菌革兰染色为阴性，菌体呈两极浓染的短杆状、圆形或卵圆形（图1B）。瑞氏染色镜检可见蓝色两极浓染、大小不一的短球杆菌（图1C）。

2.2 细菌生化鉴定结果

分离菌在接种于细菌生化鉴定管培养后，生化试验结果显示上述10株分离菌均发酵果糖、蔗糖、麦芽糖，硝酸盐、甘露醇、过氧化氢和蛋白胨水试验结果为阳性；M-R、V-P试验结果为阴性；基本符合多杀性巴氏杆菌的生化特征。对10株分离菌命名分别编号为CY01～CY10。

2.3 分离菌的16S r RNA鉴定

利用PCR扩增分离菌16S r RNA基因获得1条长度为1 450 bp的特异性条带（图2），符合预期目的基因片段大小。测序结果与NCBI数据库的猪多杀性巴氏杆菌参考菌株序列进行BLAST同源性比对，结果显示分离菌的16S r RNA基因序列与猪多杀性巴氏杆菌的序列相似性均为100%。结合分离菌培养特性和生化试验结果，表明这10株分离菌为猪多杀性巴氏杆菌，其检出率为7.87%(10/127）。

图2 分离菌株荚膜血清PCR分型鉴定电泳结果

2.4 分离菌荚膜血清PCR分型鉴定

利用多杀性巴氏杆菌荚膜血清特异性基因引物进行PCR鉴定（图3），结果显示有3株分离菌株提取的基因片段中，扩增的目的条带长度约为648 bp，符合cap D，占30.00%;1株分离菌目的条带约为760 bp，符合cap B，占10.00%;6株分离菌长度约为1 050 bp，符合cap A，占60.00%。

图3 10株分离菌株荚膜血清型PCR分型电泳结果

2.5 小鼠致病性试验结果

试验组小鼠于注射菌株后3 h开始精神不振，呆立颤抖，8 h后陆续出现死亡，36 h内死亡34只。剖检可见小鼠肝脏、肺脏等器官出血肿胀。无菌采集死亡小鼠肝脏、肺脏病料接种于TSA培养基上，培养出的菌落形态特性以及革兰氏染色和瑞氏染色镜检结果均与上述分离菌一致。

3、讨论

猪多杀性巴氏杆菌广泛存在于养猪环境和猪体正常菌群内，是一种条件致病菌，通常在猪体免疫下降或外界环境应激作用下发病，并且与其他病原体混合协同感染猪体，增加诊断和防治的难度。目前多杀性巴氏杆菌的检测技术主要是分离鉴定、PCR、ELISA、限制性酶切分析和DNA杂交等，其中应用较普遍、灵敏快速的是PCR检测，而PCR检测扩增用引物大多根据多杀性巴氏杆菌16S r DNA确定[7,8],16S r DNA基因序列越来越多地用于细菌的鉴定和分类，PCR技术是在DNA聚合酶和核苷酸底物作用下，以母链DNA为模板，经过预变性、变性、退火、延伸等反应程序，体外扩增复制出与母链模板DNA互补的子链DNA[9]。

多杀性巴氏杆菌荚膜决定其致病力，不同荚膜血清型致病力存在差异，且它们之间交叉免疫保护力较弱，因此，荚膜血清分型鉴定对提高诊治效率和有效性具有重要意义。彭忠等[10]报道，当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。张哲玮等[11]对来自广西、湖北、内蒙古3个地区规模化猪场中有呼吸道症状猪的口鼻拭子及组织病料进行病原菌分离鉴定。结果显示，分离得到6株猪多杀性巴氏杆菌，其中血清A型1株、血清D型5株。林星宇等[12]从四川、重庆、云南等地8个规模化养殖场的125份病死猪肺炎样品中，分离出11株多杀性巴氏杆菌，其中有7株为A血清型（63.6%）、3株为D血清型（27.3%）。本研究结果显示，从河南长垣市猪群采集的127份病料中，分离鉴定出10株多杀性巴氏杆菌，检出率为7.87%，优势荚膜血清流行株为A型（60.00%）和D型（30.00%），与上述学者报道结果相一致，且符合我国动物源多杀性巴氏杆菌血清型多为荚膜A型的流行情况[13,14,15]。本次动物致病力试验小鼠死亡率较高，为68.00%(34/50），表明多杀性巴氏杆菌致病性较强。本研究虽然采样数量偏少，但也可以说明多杀性巴氏杆菌病在该地有一定的流行性，应引起重视。

4、小结

本研究对河南省长垣市部分猪场多杀性巴氏杆菌进行分离培养、生化鉴定、PCR分子鉴定和荚膜血清分型，结果发现，从127份鼻拭子样品中检测出10株多杀性巴氏杆菌，检出率为7.87%，血清A和D型为当地主要优势血清型，动物试验证明分离菌株致病菌毒力较强。应加强监测，开展综合防治。

参考文献:

[1]朱中成.对猪多杀性巴氏杆菌病病例诊治体会[J].中国猪业,2023,18(2):86-88,91.

[4]王喜,元正菊,张信艳,等.鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析[J].中国兽医科学,2021,51(11):1411-1419.

[5]朱飞舟,陈利玉,陈汉春.16S r RNA基因序列分析法鉴定病原细菌[J].中南大学学报(医学版),2013,38(10):1035-1041.

[6]李红婕,董紫凡,车勇良,等.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及opp A基因遗传进化分析[J].中国畜牧兽医,2022,49(12):4786-4794.

[7]亓英芳,刘家森,张在平,等.巴氏杆菌PCR诊断方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医,2018,(7):68-69.

[8]施少华,程龙飞,傅光华,等.检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法的建立[J].福建农业学报,2009,24(3):201-204.

[9]刘娣琴.PCR技术在动物医学方面的研究进展[J].国外畜牧学(猪与禽),2013,33(7):101-102.

[10]彭忠,王庚,吴广敬,等.猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定[J].中国兽医科学,2015,45(9):943-951.

[11]张哲玮,曹维维,代小童,等.猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定､血清分型及耐药性分析[J].中国兽医学报,2023,43(5):930-936.