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猪不同颜色皮肤组织中MLANA mRNA的分析

2023-10-30 73 上传者：管理员

摘要：为了解MLANA mRNA在猪黑、白色皮肤中的表达差异，提取剑白香猪黑、白色皮肤组织的RNA,分别逆转录合成MLANA cDNA,以RPS18基因作为内参，采用实时荧光定量PCR检测MLANA mRNA在皮肤组织中的相对表达量。结果：MLANA mRNA在黑色皮肤中的表达量比白色皮肤高，差异极显著(P<0.01),推测MLANA基因与猪黑色皮肤的形成有关。

关键词：
MLANA mRNA
猪
皮肤组织
相对表达
遗传标记
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皮肤颜色是猪品种的重要表征之一，属于表型遗传标记，在确定杂交组合、品种纯度和亲缘关系以及评价产品质量等方面有重要作用[1]。哺乳动物皮肤颜色是真黑素和棕黑素在黑色素细胞中合成、转化导致的结果[2]。MLANA(黑色素A基因)又称 MART1,与黑色素细胞分化、黑素体运输、发育性色素沉着、黑色素生物合成有关，通过维持GPR143(G 蛋白偶联受体143)的稳定性参与黑素体的产生，对黑色素细胞蛋白PMEL的表达、稳定、转运和加工至关重要[3]。PMEL是形成黑素体必需的黑素细胞特异性糖蛋白，沉默PMEL基因可抑制黑素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，促使细胞凋亡[4]。PMEL的正常表达及功能的发挥是成熟黑素体形成的关键，是干扰黑素体形成的关键靶点[5]。本研究以剑白香猪为研究对象，探究MLANA mRNA在剑白香猪黑、白色皮肤组织中的表达差异，为MLANA基因功能的进一步研究提供参考。

1、材料与方法

1.1 检测样品

分别采集贵州大学香猪育种场的健康剑白香猪背、腹的白色皮肤和耳部的黑色皮肤，置于1.5 mL离心管中液氮暂存，随后置于 -80 ℃保存。

1.2 主要仪器

电泳仪(型号：DYY-2C,北京六一仪器厂)、凝胶电泳图像分析系统(型号：ChemiDoc XRS,美国Bio-Rad 公司)、荧光定量 PCR仪(型号：CFX96,美国Bio-Rad公司)、PCR扩增仪(型号：GeneAmp9600,美国 ABI公司)。

1.3 主要试剂

Trizol试剂、SYBR Green supermix(均购自美国 Life technologies公司),DL 2 000 DNA Marker(购自宝生物工程有限公司),反转录试剂盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)、2×Es Taq MasterMix、核酸染料(均购自北京康为试剂科技有限公司)。

1.4 引物

分别以GenBank中的猪MLANA mRNA(Gene ID:100520532;GenBank: GFLN01126290.1)RPS18基因(NM_213940.1)为参考序列，利用Primer Premier 5.0软件设计2对特异引物，引物由北京擎科生物科技有限公司(重庆)合成。引物信息见表1。

1.5 皮肤组织RNA的提取和反转录

采用Trizol法分别提取各组织样品的总RNA,按反转录试剂盒说明书方法分别反转录黑、白色皮肤组织的RNA,反应体系20 μL(见表2)。反应程序：42 ℃保温15 min, 加入反转录酶(HiFi Script),42 ℃孵育30 min, 85 ℃灭活5 min。

表1 引物信息

表2 皮肤组织RNA的反转录体系

1.6 cDNA浓度及纯度检测

使用微量紫外分光光度计分别测定黑、白色皮肤组织反转录产物cDNA浓度，测定260、230、280 nm波长处的吸光度值，以A260 nm/A280 nm评估蛋白质污染，A260 nm/A230 nm评估有机溶剂残留，判定cDNA纯度，纯净DNA样品的比值应 >1.8。

1.7 MLANA CDS区部分序列的PCR扩增

PCR扩增MLANA cDNA部分片段，反应体系20 μL:2×Es MasterMix(Dye)10 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA(100 ng/μL)2 μL,ddH2O 7 μL。反应程序：94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s, 45 ℃退火1 min, 72 ℃延伸30 s, 共30个循环；72 ℃延伸2 min, 12 ℃终止反应。

1.8 琼脂糖凝胶电泳

用微量移液枪分别取DL 2 000 DNA Marker、PCR产物 5 μL于1%琼脂糖凝胶进行电泳。电泳条件：电压120 V,电流100 mA,电泳30 min。

1.9 MLANA mRNA的qRT-PCR检测

采用SYBR Green荧光染料法进行qRT-PCR检测，反应体系10 μL:2 ×Ultra SYBR Mixture 5 μL,上、下游引物各 0.5 μL,cDNA(100 ng/μL)1 μL,ddH2O 3 μL。每个样品设3个重复。反应程序：95 ℃预变性 10 min; 95 ℃变性 15 s, 45 ℃退火1 min, 共38个循环。循环结束后进行熔解曲线分析，分析条件：95 ℃ 5 s, 65 ℃ 5 s, 95 ℃ 5 s。

1.10 数据分析

使用Microsoft Excel 2010进行数据统计分析，采用2-△△CT法计算各样品中MLANA mRNA的相对表达量。计算公式：ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(内参基因);ΔΔCt=ΔCt(黑色/白色皮肤组织)-ΔCt(白色皮肤组织)。

2、结果与分析

2.1 cDNA的合成与测定

经测定，剑白香猪黑色皮肤组织A260 nm/A280 nm=1.82,浓度为891.8 ng/μL;白色皮肤组织A260 nm/A280 nm=1.8,浓度为640.1 ng/μL。可进行后续测试。

2.2 MLANA CDS区部分序列的PCR扩增结果

由图1可见：黑色皮肤组织扩增条带约219 bp, 与预期相符，白色皮肤组织扩增未见目的条带。经序列同源比对分析，与NCBI中的MLANA基因相似度为99%(见图2),表明PCR扩增序列为MLANA基因片段，引物特异性好。

图1 不同颜色皮肤组织MLANA cDNA的PCR扩增结果

图2 序列同源比对结果

2.3 香猪不同颜色皮肤组织中MLANA mRNA的qRT-PCR检测

由图3可见：qRT-PCR扩增曲线拐点清晰，斜率较高，表明MLANA mRNA扩增效率较高；熔解曲线均为光滑的单峰曲线，且退火温度附近无明显杂峰，引物特异性、重现性好，无明显引物二聚体出现，说明MLANA mRNA qRT-PCR 结果可信度高。RPS18基因曲线整体平行性较好，曲线拐点清楚，基线平而无明显上扬趋势，扩增曲线符合标准的S形增长曲线；熔解曲线均为单峰，没有出现非特异性扩增及引物二聚体，表明引物的特异性良好，反应体系适合。

图3 MLANA mRNA和RPS18基因qRT-PCR的扩增曲线和熔解曲线

2.4 MLANA mRNA在剑白香猪不同颜色皮肤组织中的表达

由图4可见：MLANA mRNA在黑色皮肤组织中表达量是白色皮肤的2 350倍，差异极显著(P<0.01)。

图4 MLANA mRNA在剑白香猪黑色和白色皮肤组织中的相对表达量

3、结论

MLANA mRNA在猪黑色皮肤组织中具有较高的表达量，而在白色皮肤组织中几乎不表达，推测MLANA基因与猪黑色皮肤的形成有关。

4、讨论

猪皮肤颜色的遗传机制较复杂，决定基因较多，且基因之间存在上位效应等复杂的基因互作[6]。MLANA表达仅限于黑色素细胞、黑色素瘤和视网膜色素上皮细胞，定位于囊泡，包括黑素体[7]。研究发现，MLANA基因所在信号通路影响家禽羽色的形成，MLANA的下调表达可能是造成白羽的原因之一，在不同羽色的朗德鹅、鸭中均被证实[8,9]。Xiong Q等[10]通过qRT-PCR技术进行转录组测序分析，证明MLANA在杂交山羊黑色和白色皮肤中存在显著的差异表达(P<0.05),与白色皮肤相比，黑色皮肤中的表达明显升高。MLANA基因的高表达对黑色素的合成具有重要作用。目前，MLANA基因在皮肤组织中的生物学功能研究较少，MLANA与PMEL之间的相互作用对黑色素含量影响的研究也较少。本研究结果表明MLANA mRNA在黑色皮肤组织中具有较高的表达量，下一步需结合基因的多态性和基因间的相互关系，研究MLANA基因在猪黑色和白色皮肤组织中的功能。

参考文献:

[1]施启顺.猪的毛色遗传[J].养猪,2006(3):21-24.

[2]白春雨,高玉花,庞全海.影响动物毛色的基因[J].国外畜牧学(猪与禽),2008(5):71-73.

[5]王磊,刘军.黑色素形成分子机制研究进展[J].新疆大学学报(自然科学版),2019,36(4):468-474,499.

[6]张建,陈伟,王慧,等.猪毛色遗传机制的研究进展[J].猪业科学,2013,30(1):100-103.

[8]丁颖,邢娅,王倩倩,李文博,等.TYRP1和MLANA影响朗德鹅羽色形成的机制研究[J].中国家禽,2018,40(9):6-10.

[9]蒋兵兵,黄曼曼,白天,等.鸭不同羽色毛囊组织差异表达基因转录组测序分析[J].农业生物技术学报,2020,28(9):1 623-1 634.

基金资助:猪不同毛色皮肤组织MLANA基因mRNA的表达分析”贵州大学SRT计划项目[贵大SRT字(2021)055];

文章来源:袁茂莎,陈伟,袁丹等.猪不同颜色皮肤组织中MLANA mRNA的表达分析[J].贵州畜牧兽医,2023,47(05):10-12.