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黔中金荞麦醇提物对断奶仔猪肠道菌群的影响

2023-10-30 61 上传者：管理员

摘要：为了探究黔中金荞麦醇提物对断奶仔猪肠道菌群的影响，选取12头健康的断奶柯乐仔猪平均分为2组，Ⅰ组(试验组)饲喂98.5%基础日粮+1.5%黔中金荞麦提物，Ⅱ组(对照组)饲喂100%基础日粮，第15 d采集直肠粪便利用高通量测序技术分析仔猪肠道菌群的变化。结果：(1)Ⅰ组的细菌OTU(运算分类单元)数比Ⅱ组大，真菌OTU数比Ⅱ组小，2个组的细菌菌群丰富度差异不显著(P>0.05);Ⅰ组的细菌菌群多样性比Ⅱ组大，真菌菌群丰富度和多样性比Ⅱ组小，细菌群落结构差异显著(P<0.05)。(2)细菌分类：门水平主要有厚壁菌门(51.88%、36.17%)、拟杆菌门(32.23%、26.90%)、变形杆菌门(4.26%、22.17)等，属水平主要有埃希菌-志贺菌属(1.77%、15.56%)、琥珀酸弧菌属(1.51%、7.87%)、乳杆菌属(4.87%、2.34%)等；真菌分类：门水平主要有子囊菌门(40.67%、46.65%)、新美鞭菌门(35.56%、9.02%)、担子菌门(5.48%、7.16%)等，属水平主要有新美鞭菌属(35.36%、9.02%)、曲霉属(12.94%、16.18%)、丝孢酵母属(5.76%、3.48%)等。Ⅰ组的细菌差异物种数比Ⅱ组大，真菌差异物种数比Ⅱ组小。结论：饲喂黔中金荞麦醇提物可显著影响断奶仔猪肠道菌群结构，表现为有益菌群丰富度提高，有害菌群丰富度降低。

关键词：
断奶仔猪
细菌菌群
肠道菌群
高通量测序
黔中金荞麦醇提物
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黔中金荞麦是贵州省畜牧兽医研究所科研人员以黔中地区野生金荞麦为原材料经过驯化选育的牧草新品种(品种登记号：581),遗传性状稳定、抗逆性强、营养丰富、根系发达、生长快且产量高，是畜禽喜食的多年生优质牧草[1]。本项目组前期研究结果表明，黔中金荞麦醇提物能抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的生长，且对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好[2]。其他研究表明，利用黔中金荞麦中药复方制剂饲喂仔猪能有效抑制肠内大肠杆菌、沙门氏菌生长，可防治仔猪早期断奶应激[3];在饲料中添加1%～2%黔中金荞麦能减少仔猪直肠粪便中大肠杆菌、沙门氏菌的含量[4]。本试验通过在饲粮中添加黔中金荞麦醇提物饲喂断奶仔猪，利用高通量测序技术分析仔猪肠道菌群结构的变化，为黔中金荞麦在畜禽养殖上的深入开发利用提供参考依据。

1、材料与方法

1.1 材料

(1)试验药物：黔中金荞麦根60%乙醇提取物，由贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药研究室提供。(2)试验猪：28日龄健康、体重相近的断奶柯乐猪12头，由贵州省畜牧兽医研究所兽医试验场提供。

1.2 试验设计

试验猪随机平均分为Ⅰ 组(试验组)和 Ⅱ 组(对照组),每组2个重复，每个重复3头。Ⅰ 组饲喂98.5%基础日粮+1.5%黔中金荞麦提物，Ⅱ 组饲喂100%基础日粮。日粮配方参照《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)配制(见表1)。预试期3 d, 正试期15 d, 各组饲养环境和管理完全相同。

表1 基础日粮配方

1.3 样品采集与基因组PCR扩增

试验期间Ⅰ组仔猪未发生腹泻，Ⅱ组仔猪在第6 d发生腹泻。第15 d采集2组仔猪直肠粪便，提取样品DNA并检测纯度和浓度，以DNA为模板扩增细菌16S V3-V4高变区(341F/806R)、真菌ITS1-1F高变区(TS1-1F-F/ITS1-1F-R)。基因组PCR扩增、文库构建、高通量测序由北京诺禾致源科技股份有限公司协助完成。

1.4 测序数据处理与分析

将每个样品测序获得的读段进行拼接得到原始标签数据，过滤处理原始标签序列得到高质量的标签数据，利用QIIME软件对标签数据进行质量控制，质控后的标签序列去除其中的嵌合体序列，获得最终的有效数据进行分析[5]。对样品信息进行Alpha多样性(Alpha Diversity)分析和多组间比较(Beta diversity),分析肠道菌群的多样性和丰富度，使用物种差异判别(LEfSe)分析组间物种差异显著性。

1.5 数据统计

试验数据应用图基检验(Tukey test)分析差异显著性，结果以“平均数±标准差”表示。

2、结果与分析

2.1 OTU聚类分析

高通量测序得到2组菌群基因序列数和OTU数(见表2)。16S rRNA分析中，Ⅰ组的平均原始序列数和OTU数均大于Ⅱ组；ITS rRNA分析中，Ⅰ组的平均原始序列数大于Ⅱ组，OTU数和特有OTU数小于Ⅱ组，结果表明2组样品细菌和真菌的OTU聚类数有一定差异。

表2 各组仔猪肠道菌群基因统计

2.2 肠道菌群的Alpha多样性分析

Alpha多样性指数分析可反映样本复杂度，其中估计物种总数(Chao 1)和群落OTU数目(ACE)指数用来估计群落中的生物丰富度。由表3可见：2组样品的细菌菌群丰富度相似，Ⅰ组的真菌菌群丰富度比Ⅱ组小。Simpson、Shannon指数用于描述物种多样性和均匀度，Ⅰ组的细菌菌群多样性比Ⅱ组大，真菌菌群多样性比Ⅱ组小。2组样品细菌和真菌对应的Chao 1、ACE、Simpson、Shannon指数差异不显著(P>0.05),表明样品中细菌和真菌的菌群丰富度和多样性无明显差异。

表3 Alpha多样性指数

2.3 肠道菌群的Beta多样性分析

基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)样品间菌群结构的多样性。由图1可见：细菌类主成分1、2的贡献率分别为总变量的34.56%、14.77%,真菌类主成分1、2的贡献率分别为总变量的41.57%、26.74%,各组样品菌群间没有单独聚类，表明2组样品的主要菌群结构相似。由表4可见：基于Bray-Curtis距离的多重响应排列程序分析(MRPP)得出细菌和真菌的A值均大于0,说明2组菌群的群落结构组间差异大于组内差异，其中细菌群落结构差异显著(P<0.05)。

图1 各组菌群PCoA分析

表4 各组菌群结构差异显著性检验

2.4 肠道菌群的多样性和丰富度

2.4.1 细菌

经分类学鉴定，2组样品细菌归属于22门，39纲，73目，119科，236属，348种。由表5可见：(1)细菌分类的门水平主要有厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形杆菌门(Proteobacteria)、弯曲杆菌门(Campylobacterota)、螺旋体门(Spirochaetota)。Ⅰ组中的厚壁菌门、拟杆菌门相对丰富度均大于Ⅱ组，但变形杆菌门、弯曲杆菌门、螺旋体门丰富度均小于Ⅱ组。(2)属水平结果显示，Ⅰ组的理研菌科_RC9菌属(Rikenellaceae_RC9)、乳杆菌属(Lactobacillus)、颤螺旋菌科UCG-005菌属(Oscillospiraceae _UCG-005)、颤螺旋菌科UCG-002菌属(OscillospiraceaeUCG-002)等相对丰富度均大于Ⅱ组；Ⅱ组主要有埃希菌-志贺菌属(Escherichia-Shigella)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)、普雷沃氏菌科NK3B31菌属(Prevotellaceae_NK3B31)、密螺旋体属(Treponema)、弯曲杆菌属(Campylobacter)等，相对丰富度均大于Ⅰ组。由图2可见：在属水平上有12个菌群丰富度较高，其中脱硫弧菌属(Desulfovibrio)差异极显著(P<0.01),理研菌科RC9菌属、普雷沃氏菌科UCG-003菌属(Prevotellaceae_UCG-003)、厌氧弧菌属(Anaerovibrio)、Subdoligranulum等菌群差异显著(P<0.05)。

表5 细菌分类门水平和前10属水平的相对丰富度

图2 细菌属水平T_test组间物种差异分析

2.4.2 真菌

2组样品真菌共获得16门，55纲，134目，308科，610属，874种。由表6可见：(1)真菌分类的门水平主要有新美鞭菌门(Neocallimastigomycota)、子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、被孢菌门(Mortierellomycota)。Ⅰ组的新美鞭菌门(40.67%)、组子囊菌门(35.36%)为最优菌门，Ⅱ组的子囊菌门(46.65%)为最优菌门。(2)属水平结果显示，2组的优势菌属有新美鞭菌属(Neocallimastix)、丝孢酵母属(Trichosporon)、曲霉属(Aspergillus)等，其中Ⅰ组的新美鞭菌属、曲霉属丰富度高于Ⅱ组，丝孢酵母属、枝顶孢属(Acremonium)丰富度低于Ⅱ组。由图3可见：在属水平上有4个菌群丰富度较高且差异显著(P<0.05),主要是青霉菌属(Penicillium)、白僵菌属(Beauveria)、刺囊壳属(Ascotricha)、木霉属(Trichoderma)。

表6 真菌分类门水平和前10属水平的相对丰富度

图3 真菌属水平T_test组间物种差异分析

2.5 肠道菌群的物种差异分析

对2组样品进行LEfSe分析，在LDA阈值为3的条件下，Ⅰ 组菌群中有31个具有统计学差异的物种，其中肠杆菌属、理研菌属、链球菌属(Streptococcus)等LDA值较高；Ⅰ 组中有10个细菌物种差异显著，其中变形菌门、埃希菌-志贺菌属、肠杆菌目等LDA值较高(见图4 A、C)。Ⅱ组真菌检测出33个差异物种，其中LDA值较高的有粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、枝顶孢属等(见图4 B、D)。LEfSe分析表明Ⅰ组的细菌差异物种数大于Ⅱ组，真菌差异物种数小于Ⅱ组。

图4 细菌和真菌的物种差异LDA柱状图和进化分支

3、结论

饲喂黔中金荞麦醇提物可显著影响断奶仔猪肠道菌群结构，表现为有益菌群丰富度提高，有害菌群丰富度降低。

4、讨论

4.1 黔中金荞麦含有萜类、酚类、黄酮类等化学成分[6,7]。黄酮类化合物能够通过调控肠道菌群的多样性、结构和代谢产物，维持胃肠道的微生物生态防御系统平衡[8]。多酚类化合物原花青素能够调节肠道菌群的组成和代谢产物，与肠黏膜免疫系统发生相互作用，从而调节肠道免疫应答[9]。此外，其含有的绿原酸可调节仔猪肠道菌群，促进营养物质消化吸收，维持肠道稳态[10]。本研究中2组样品主要菌群的相对丰富度和种类差异大，说明黔中金荞麦醇提物可显著影响仔猪肠道菌群的结构。

4.2 在猪肠道菌群中，优势门类有厚壁菌门、拟杆菌门、变形杆菌门、放线菌门、螺旋体门等[11],优势属有乳杆菌属、理研菌属、密螺旋菌属、肠杆菌属、普雷沃氏菌属等[12]。本研究中仔猪肠道菌群的优势门和属与上述报道一致，通过LEfSe分析表明，2组样品细菌中分别有31、10个差异菌种。这些菌种的差异对仔猪的肠道健康非常关键，如：乳杆菌具有益生菌活性，可降低消化道的pH值，释放抗菌和毒素灭活物质，降低仔猪腹泻的发生率[13];厚壁菌门产生的丁酸经氧化作用为肠道黏膜上皮细胞提供能量；拟杆菌属产生的丙酸参与肝脏糖异生，为组织提供必要的能源[14]。而密螺旋体会引起血痢[15],埃希菌-志贺菌属可引起仔猪腹泻[16]。本试验中Ⅰ组的致病菌埃希菌-志贺菌属、密螺旋体属的丰富度低于Ⅱ组，厚壁菌门、拟杆菌门、乳杆菌属的相对丰富度高于Ⅱ组。在真菌分类水平上，2组主要有子囊菌门、担子菌门、被孢菌门，优势属有新美鞭菌属、丝孢酵母属、曲霉属等，这与动物肠道真菌的组成基本一致[17]。LEfSe分析表明，Ⅱ组检测出33个差异菌种。其中与腹泻正相关的病原真菌有担子菌门、曲霉属[18];致病真菌念珠菌属与肠道炎症密切关联，发病期间念珠菌属含量较高[19]。而子囊菌门、新美鞭菌属等有利于预防腹泻[18];酵母菌具有抗菌消炎、抗病毒、提高动物机体免疫力等功能[20]。本试验中Ⅰ组致病真菌担子菌门、曲霉属、念珠菌属的丰富度均低于Ⅱ组，有益真菌子囊菌门、新美鞭菌属、丝孢酵母属的丰富度高于Ⅱ组。黔中金荞麦醇提物饲喂断奶仔猪后，通过降低仔猪肠道中密螺旋体属、埃希菌-志贺菌属、链球菌属、曲霉属、念珠菌属等致病微生物的丰富度，提高有益微生物，如乳杆菌属、拟杆菌属、新美鞭菌属、酵母属等的丰富度，从而维持仔猪肠道健康，减少如腹泻等疾病的发生，但其相关的影响机制还需进一步研究。

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基金资助:“金荞麦活性物质提取工艺的优化与猪用功能性饲料添加剂的研发”贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2020]1Y082号);“贵州地方猪新品种培育及良繁”贵州省科技计划项目(黔科合支撑[2022]重点032号);“猕香猪养殖新技术集成与示范”贵阳市科技计划项目(筑科合同[2022]5-25号);“生猪无抗生素养殖技术成果转化”贵阳市科技计划项目(筑科合同[2022]5-31号);

文章来源:唐远江,刘辉,向清华等.黔中金荞麦醇提物对断奶仔猪肠道菌群的影响[J].贵州畜牧兽医,2023,47(05):19-24.