首页 > 论文范文 > 农业科技论文 > 畜牧综合论文 > 生猪养殖论文 > 阿魏酸植物甾醇酯体内外抗猪细小病毒作用研究

阿魏酸植物甾醇酯体内外抗猪细小病毒作用研究

2023-11-20 164 上传者：管理员

摘要：旨在探究阿魏酸植物甾醇酯体内外抗猪细小病毒(PPV)作用。采用CCK-8法检测阿魏酸植物甾醇酯对PK-15细胞的安全浓度，明确最佳给药浓度，并采用RT-qPCR检测病毒增殖情况，ELISA检测细胞炎症因子分泌水平，Western blot检测线粒体自噬相关蛋白的表达水平。体内试验是给豚鼠注射PPV后灌胃阿魏酸甾醇酯，检测性腺PPV含量、血清中HI抗体含量。结果显示，阿魏酸植物甾醇酯对PK-15细胞的最高安全浓度为40μmol/mL。阿魏酸植物甾醇酯呈剂量依赖性关系显著降低PPV的病毒增殖；与空白组相比，阿魏酸植物甾醇酯显著降低PPV感染PK-15诱发细胞炎症因子IL-12、IL-17、MIP-1α、TGF-β、PGK1、IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α的表达。此外，阿魏酸植物甾醇酯显著降低PPV感染PK-15诱发线粒体自噬相关蛋白ATG3、Becline1、P62、Pink1、Parkin表达，抑制细胞线粒体自噬发生。体内试验表明阿魏酸植物甾醇酯大、中剂量组有效抑制PPV复制。说明阿魏酸植物甾醇酯体内有具有良好的抗细小病毒活性。

关键词：
兽医临床
猪
猪细小病毒
线粒体自噬
阿魏酸植物甾醇酯
加入收藏

猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)作为细小病毒属成员，是引起母猪繁殖性障碍的重要病原之一[1,2]。母猪感染猪细小病毒主要引起不孕、畸形胎、木乃伊胎、流产、产死胎等临床症状[3,4]。兽医临床表明PPV常和其他病毒混合感染，其中以猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒等为主的混合感染较为严重，且PPV感染呈现上升趋势。PPV可以感染各个生长阶段的猪群，并在全球猪场中流行。当前兽医临床防治猪细小病毒主要依靠疫苗防控[5,6]。疫苗防控大力提升了猪的存活能力，但对宿主和机体产生一定的毒性[7,8]。现在兽医临床报道多种抗细小病毒化合物和多种细小病毒疫苗，但其用量大且易耐药。亟待筛选和明确新的抗病毒药物是防控病毒的迫切需求。

前期研究发现，阿魏酸作为当归、阿魏和川芎等中药主要活性成分具有抗病毒、抗氧化、降胆固醇、抗菌、抗炎、抗癌和促进免疫等生理活性。然而，阿魏酸亲水性强、脂溶性差、生物利用率低，这极大地限制了其实际应用。植物甾醇是一种天然疏水活性成分，具有优良的降脂功效。阿魏酸与植物甾醇结合形成阿魏酸植物甾醇酯，不但可以改善前者的脂溶性、拓宽应用范围，还兼具二者生物活性的潜力，应用前景广阔[8]。本研究通过构建细胞模型，对阿魏酸植物甾醇酯抗猪细小病毒增殖和作用机制进行了深入的评估，以期为进一步开发抗猪细小病毒的药物提供基础数据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒

PK-15细胞系由本实验室冻存保存，PPV病毒滴度1.0×10-6 TCID50/mL,由山东省滨州市畜牧兽医研究院沈志强课题组赠送。

1.1.2 主要试剂

DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗、0.25%胰酶-EDTA、RIPA裂解液等，均为中国南京碧云天生物技术有限公司产品。CCK-8试剂盒、荧光定量SYBR Premix Ex Taq试剂盒，均为中国诺唯赞生物工程(南京)有限公司产品。阿魏酸和植物甾醇(纯度>98%),中国河南研邦生物科技有限公司产品；离子液体(纯度>99%),中国上海成捷化学有限公司产品。

1.1.3 主要仪器

Thermo多功能酶标仪(C100 Touc),中国上海木森生物科技公司产品；智能生化培养箱 (LRH-250),中国郑州生元仪器有限公司产品；核酸蛋白定量仪(JP-3008),中国上海金鹏分析仪器有限公司产品；旋转蒸发仪(RE-5299),中国郑州科达机械仪器设备有限公司产品；高效液相色谱(LC8600),中国南京科捷仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 阿魏酸植物甾醇酯的合成

准确称取一定量的离子液体，配制成1 000 mg/mL的乙醇溶液。将配好的离子液体乙醇溶液加入100 mL圆底烧瓶中，减压真空去除乙醇，称取β-谷甾醇(0.02～0.10 g)、阿魏酸(0.03～0.09 g)、选定的反应溶剂(50 mL)和磁力搅拌子加入到圆底烧瓶中。油浴加热回流4 h。应用薄层色谱法(Thin layer chromatography, TLC)和高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)检测反应情况。反应结束后，反应体系加弱碱去除未反应的阿魏酸，之后收集上层的甲苯层样品，通过旋转蒸发去除溶剂，采用硅胶柱样品进行分离纯化。使用TLC和HPLC检测对样品进行检测分析，得到纯品。经质谱分析阿魏酸植物甾醇酯的相对分子质量为m/z 590。

1.2.2 阿魏酸植物甾醇酯对PK-15细胞的安全浓度测定

取对数期PK-15细胞，调整细胞悬液浓度约为3×105个/mL,加入96孔板，待细胞长至单层后，吸弃孔中培养液，用磷酸缓冲液(PBS)洗2遍，加入用无血清培养基递次2倍稀释得到的一系列浓度(640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、0 μmol/mL)的阿魏酸植物甾醇酯，每个浓度设 8个重复孔，每孔150 μL,置37℃培养箱培养48 h后弃去药液，每孔加10 μL CCK-8溶液和90 μL无血清培养基，继续培养2 h后用酶标仪测定各孔的OD450值。试验中同时设立空白细胞对照组和阴性对照组。相同方法重复3次。利用以下公式计算每孔细胞的存活率：细胞存活率(%)=(试验组OD450值-空白细胞对照组OD450值)/(阴性对照组OD450值-空白细胞对照组OD450值)×100。

1.2.3 阿魏酸植物甾醇酯对PPV增殖的抑制试验

根据1.2.2中筛选的阿魏酸植物甾醇酯的最佳安全浓度，将PK-15细胞感染MOI=1的PPV后给与阿魏酸植物甾醇酯，同时设置空白对照组和病毒组，分别在0、12、24、36和48 h收集病毒上清液和细胞样品，使用Reed-Muench法测定每个时间点病毒上清液的TCID50,获得PPV在PK-15细胞中的增殖情况。

1.2.4 阿魏酸植物甾醇酯对PPV诱导PK-15细胞炎症因子的影响

将PK-15细胞感染MOI=1的PPV后给与阿魏酸植物甾醇酯5、10、20 μmol/L,培养48 h后弃上清液，PBS清洗3次，收集细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA,采用核酸蛋白定量仪器检测总RNA的浓度和纯度。ELISA方法检测细胞上清液中IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α分泌水平。参考文献中RT-PCR的反应方法和反应体系检测IL-12、IL-17、MIP-1α、TGF-β、PGK1的动态表达，引物序列见表1。结果以2-△△Ct法分析基因的表达水平。

表1 引物序列

1.2.5 阿魏酸植物甾醇酯对PPV诱导PK-15细胞线粒体凋亡信号通路的影响

将PK-15细胞感染MOI=1的PPV后给与阿魏酸植物甾醇酯5、10、20 μmol/L,培养48 h后收集上清液，PBS清洗3次，收集细胞，提取其线粒体，检测线粒体数量，线粒体长度。ELISA方法检测上清液中caspase-3、caspase-9的分泌水平，Western blot方法检测线粒体自噬相关蛋白ATG3、Becline1、p62、Pink1、Parkin。结果以2-△△Ct法分析基因的表达水平。

1.2.6 阿魏酸植物甾醇酯对PPV诱导豚鼠体内增殖试验

160只健康豚鼠(体质量约280 g, 郑州大学动物中心产品)。随机分PPV组、阿魏酸植物甾醇酯大、中、小剂量(200、100、50 mg/kg)组共计5组，各组肌肉注射104.5 TCID50剂量的PPV攻毒，攻毒后各组给予相应的药物。攻毒后第28天，心脏采血，β-微量法测定血清特异性HI抗体，RT-PCR测定性腺PPV含量。

1.2.7 数据分析

采用SPSS 22.0软件对数据进行平均值、标准差和P值的计算，所得结果用“平均值±标准差(Mean±SD)”表示。使用单因素方差分析对数据进行统计评估。使用Graphpad Prism 7.0软件进行药物半数致死量(LD50)和药物半数有效量(ED50)的计算，按公式TI= LD50/ED50计算相应的治疗指数。

2、结果

2.1 阿魏酸植物甾醇酯对PK-15细胞的安全浓度

采用梯度稀释的方法用0～640 μmol/mL的阿魏酸植物甾醇酯处理PK-15细胞，培养48 h后，采用CCK-8方法检测其细胞存活率，根据存活率>80%判定为安全，结果表明在浓度低于40 μmol/mL阿魏酸植物甾醇酯对PK-15细胞安全无毒副作用(图1)。阿魏酸植物甾醇酯对PK-15细胞的安全浓度为0～40 μmol/mL。

2.2 阿魏酸植物甾醇酯对PPV病毒体外抑制效果

结果表明PPV随着时间的增长，病毒表达水平和病毒滴度升高(图2A和2B),但阿魏酸植物甾醇酯浓度为40 μmol/mL能有效抑制PPV病毒表达水平和病毒滴度且随着时间的变化呈现依赖性(图3C和3D)。与PPV(MOI=1)相比，阿魏酸植物甾醇酯浓度为40 μmol/mL在24 h和48 h显著抑制PPV的病毒表达水平和病毒滴度(P<0.01,图2E和2F)。

图1 阿魏酸植物甾醇酯对PK-15细胞活力测定

图2 阿魏酸植物甾醇酯对PPV病毒抑制效果

2.3 阿魏酸植物甾醇酯对PPV引起的细胞因子表达的影响

与control组相比，PPV感染PK-15细胞中，诱导IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α分泌增加，促进IL-12、IL-17、MIP-1α、TGF-β、PGK1 mRNA表达水平增加(P<0.01)。与PPV组相比，阿魏酸植物甾醇酯抑制PPV感染PK-15细胞诱导的IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α分泌增加，抑制IL-12、IL-17、MIP-1α、TGF-β、PGK1 mRNA表达水平增加(P<0.01),结果见图3。

图3 阿魏酸植物甾醇酯对IL-1β、IFN-γ、IL-6、TNF-α、IL-12、IL-17、MIP-1α、TGF-β、PGK1表达的影响

2.4 阿魏酸植物甾醇酯对PPV诱导PK-15细胞线粒体凋亡信号通路的影响

与control组相比，PPV感染可以减少细胞中线粒体数量，增加线粒体长度。与PPV组相比，阿魏酸植物甾醇酯可以增加细胞线粒体数量，降低线粒体长度(P<0.01),结果见图4A和4B。PPV感染可以激活PK-15细胞中caspase-3、caspase-9分泌水平(P<0.01),阿魏酸植物甾醇酯降低PPV激活PK-15细胞中caspase-3、caspase-9分泌水平(P<0.01),结果见图4C和4D。与对照组相比，PPV感染可以激活线粒体自噬相关蛋白ATG3、Becline1、p62、Pink1、Parkin的蛋白表达水平(P<0.01)。与PPV组相比，阿魏酸植物甾醇酯降低PPV激活PK-15细胞中线粒体自噬相关蛋白ATG3、Becline1、p62、Pink1、Parkin的蛋白表达水平(P<0.01),结果见图4E。

2.5 体内试验

2.5.1 攻毒后血清HI抗体效价的变化

图5表示PPV肌肉注射后引起豚鼠HI抗体效价的变化，结果表明阿魏酸植物甾醇酯大、中剂量组的HI抗体效价显著高于病毒对照组(P<0.01)。

2.5.2 攻毒后性腺中PPV含量

如图6所示，攻毒28 d后，阿魏酸植物甾醇酯大、中剂量组的病毒含量显著低于病毒对照组(P<0.01)。

3、讨论

猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)是一种无囊膜DNA病毒，主要引起母猪繁殖障碍性疾病，临床表现为母猪流产、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等[9,10,11,12]。PPV临床还出现多种并发症，其中与猪消瘦综合征、化脓性心肌炎以及断奶仔猪多系统衰竭综合征有关，给养猪行业带来巨大的经济损失。目前，临床上主要给母猪免疫PPV 疫苗预防该病的感染，但预防效果不理想，亟待筛选和研发抗病毒药物。近年来，天然产物因其独特化学结构及药理活性成为抗病毒药物筛选的研究热点。前期有研究发现，蜂胶提取物具有良好的抗猪细小病毒活性[13,14],进一步研究发现阿魏酸是蜂胶抗猪细小病毒主要活性成分[15]。阿魏酸由于其独特的化学结构兽医临床表现为亲水性强、脂溶性差、生物利用率低，这极大地限制了其实际应用。植物甾醇是一种天然疏水活性成分，具有优良的抗氧化、抗菌等功效。阿魏酸与植物甾醇结合形成阿魏酸甾醇酯，不但可以改善前者的脂溶性、拓宽应用范围，还兼具二者生物活性的潜力。

图4 阿魏酸植物甾醇酯对PPV诱导PK-15细胞线粒体凋亡信号通路的影响

图5 攻毒后血清HI抗体含量变化

图6 攻毒后性腺中PPV含量

本研究首先根据前期研究发现阿魏酸抗细小病毒活性，进一步合成阿魏酸植物甾醇酯，我们对其抗病毒效果进行了体内外评价，且初步探究其抗病毒作用机制。本研究结果表示，阿魏酸甾醇酯最大安全浓度下具有良好体外抗PPV效果，且能有效的抑制PPV复制，这与之前文献报道结果一致，且效果优于阿魏酸。前期研究表明，PPV感染宿主释放大量的炎症因子，炎症因子的大量释放激活细胞线粒体代谢功能障碍，且诱导细胞线粒体自噬的发生，进而诱导细胞凋亡。本研究表明，阿魏酸甾醇酯有效抑制了PPV诱导细胞大量炎症因子的释放，并且抑制细胞线粒体自噬的发生，有效的改善PPV诱导的细胞病理变化。

该研究采用豚鼠作为模式动物进一步评价阿魏酸甾醇酯体内抗病毒活性评价，结果表明，阿魏酸植物甾醇酯有效抑制PPV在性腺中扩增，且能增加抗体HI滴度，进一步证明阿魏酸植物甾醇酯具有抗细小病毒活性。

综上所述，阿魏酸植物甾醇酯具有良好的抗病毒活性，且具有良好的抗炎活性，其作用机制可能与抑制病毒诱导的线粒体自噬活化有关，研究结果为兽医临床抗细小病毒提供了新的思路。

参考文献:

[1]李亚娜,闫普普,刘佳丽,等.五味消毒饮不同极性部位对猪细小病毒体外抑制作用研究[J].畜牧与兽医,2022,54(09):114-121.

[2]徐盟龙.猪细小病毒非结构蛋白NS1通过TLR2诱导炎症反应的研究[D].郑州:河南农业大学,2022.

[3]郭振环,李向辉,张志强,等.羌活活性成分阿魏酸对猪细小病毒增殖及炎症因子表达的影响[J].动物医学进展,2022,43(03):48-52.

[4]马霞,郭振环,刘永录,等.纳米蜂胶黄酮对猪细小病毒的体内外抗病毒作用[J].中国兽医学报,2017,37(01):18-22+46.

[5]马霞,郭振环,刘永录,等.基于家兔模型的纳米蜂胶黄酮对PPV灭活疫苗免疫应答的研究[J].黑龙江畜牧兽医,2016,507(15):198-200.

[6]马霞,王长林,郭振环,等.纳米蜂胶黄酮体内外抗PPV活性试验[J].中国兽医杂志,2016,52(05):96-98.

[7]颜伟玉,谢国秀,丁黄洁,等.纳米蜂胶的制备及其对大鼠降血脂和抗氧化功能影响[J].江西农业大学学报,2013,35(02):245-248+254.

[8]芮家鑫.阿魏酸甾醇酯的合成及生物活性研究[D].镇江:江苏大学,2021.

文章来源:许芳,蔡杰,薛华平等.阿魏酸植物甾醇酯体内外抗猪细小病毒作用研究[J].动物医学进展,2023,44(11):66-71.