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奉贤区副溶血性弧菌耐药性和遗传特征

2021-12-03 206 上传者：管理员

摘要：目的分析上海市奉贤区不同来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况、耐药性和遗传特征,为副溶血性弧菌风险监测预警和溯源提供参考。方法收集2019年上海市奉贤区腹泻患者和食品风险监测中分离到的副溶血性弧菌,采用三重实时荧光PCR法检测不耐热溶血素基因(tlh)、耐热直接溶血毒素基因(tdh)和耐热相关溶血毒素基因(trh),采用微量肉汤稀释法对分离菌株进行药敏试验,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行聚类分型。结果56株副溶血性弧菌tlh基因携带率为100.00%;其中35株人源性菌株tdh和trh基因携带率分别为91.43%和8.57%,21株食源性菌株trh基因携带率为4.76%。人源性耐药株22株,耐药率为62.86%;食源性耐药株6株,耐药率为28.57%。人源性中度敏感株21株;食源性中度敏感株9株。PFGE聚类分析结果显示,56株副溶血性弧菌分为31种带型,带型相似性50.37%～100.00%。5组同源性菌株毒力基因和耐药谱均一致。结论2019年奉贤区分离的56株副溶血性弧菌遗传性较为分散,但存在主要流行克隆系。食源和人源性菌株间遗传差异较大,存在多重耐药和高毒力菌株,引起食源性疾病的风险较高。

关键词：
副溶血性弧菌
毒力基因
细菌感染
耐药性
脉冲场凝胶电泳
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副溶血性弧菌感染可引起腹痛、呕吐、腹泻和水样便等临床症状，是我国沿海地区最常见的食源性疾病病原菌[1]。近年来上海市食源性疾病暴发事件中，副溶血性弧菌感染引起的事件数占比最高，为42.59%[2]。由于临床治疗和水产养殖中抗生素的广泛使用，沿海地区副溶血性弧菌耐药水平升高[3,4,5]。本研究对上海市奉贤区2019年腹泻患者和食品样本中的副溶血性弧菌进行毒力基因检测、耐药性分析和脉冲场凝胶电泳（pulsedfieldgelelectrophoresis,PFGE）分型，了解其毒力基因携带情况、耐药谱和遗传特性，为副溶血性弧菌风险监测预警和溯源提供参考。

1、材料与方法

1.1 菌株来源

2019年上海市奉贤区共收集副溶血性弧菌56株，其中35株人源性菌株来源于哨点医院腹泻患者粪便标本，21株食源性菌株来源于国家食品安全风险监测食品标本。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与试剂

ABI7500荧光PCR仪（美国赛默飞），凝胶成像系统和脉冲场凝胶电泳及配套设备（美国Bio-Rad），浊度仪（法国梅里埃）。副溶血性弧菌tlh/tdh/trh三重实时荧光PCR检测试剂盒（北京卓诚惠生），GelRed染液（美国Biotium),SeaK-emGold琼脂糖（美国CambrexBioScienceRockland），蛋白酶K和限制性内切酶NotⅠ（大连TaKaRa),MIC药敏板A3/A4（上海星佰）。试剂均验收合格并在有效期内使用。

1.3 方法

1.3.1 毒力基因检测

采用三重实时荧光PCR法检测不耐热溶血素基因（tlh）、耐热直接溶血毒素基因（tdh）和耐热相关溶血毒素基因（trh），实验操作和结果判读严格按照试剂盒说明书。

1.3.2 药敏试验

根据临床与实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）推荐标准[6]选择耐药监测抗生素，采用微量肉汤稀释法对复方新诺明（SXT）、头孢噻肟（CTX）、头孢他啶（CAZ）、头孢西丁（CFX）、庆大霉素（GEN）、亚胺培南（IMI）、环丙沙星（CIP）、阿米卡星（AMI）、头孢吡肟（FEP）、美罗培南（MEM）、左旋氧氟沙星（LEV）、氨苄西林（AMP）、氨苄西林/舒巴坦（AMS）、阿莫西林/克拉维酸（AMC）、四环素（TET）、氯霉素（CHL）和头孢唑啉（CFZ）进行药敏试验；采用MIC药敏板A3/A4测定最低抑菌浓度。药敏试验结果判定为：敏感、中度敏感和耐药[6]。多重耐药菌指对3种或3种以上抗菌药物同时呈现耐药[7]。

1.3.3 PFGE分型

按照《2019年国家食源性疾病监测工作手册》[8]对副溶血性弧菌进行PFGE分型，调制4.3麦氏浊度的新鲜菌悬液，蛋白酶K裂解，SeaKemGold琼脂糖小胶固定，NotⅠ限制性内切酶37℃酶切4h；电泳参数为6.76～35.38s,18h；电泳后GelRed染液染色，脱色，读取电泳图谱；沙门菌标准株H9812（上海市疾病预防控制中心）作为分子量参考标准。采用BioNumerics7.0软件分析PFGE图像，采用非加权配对算术平均法（unweightedpairgroupaveragemethod,UPGMA）对电泳图谱进行聚类分析，将相似性≥85%且包含2株以上副溶血性弧菌的带型命名为克隆系，相似度100%为同源性菌株。

1.4 统计分析

采用SPSS22.0软件统计分析。定性资料采用相对数描述，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 毒力基因检测结果

56株副溶血性弧菌tlh基因携带率为100.00%，人源性菌株携带tdh和trh基因分别为32株和3株，携带率为91.43%和8.57%,1株同时携带tdh和trh基因。食源性菌株携带trh基因1株，携带率为4.76%；未检出携带tdh基因。不同来源副溶血性弧菌tdh基因携带率差异有统计学意义（χ2=45.861,P<0.001）。

2.2 药敏试验结果

检出人源性耐药株22株，耐药率为62.86%，其中对1种抗生素耐药20株，以耐CFZ为主；对2种抗生素耐药1株，为耐CFZ和AMP；多重耐药菌1株，对CFZ、CTX、CAZ、CFX、AMI和FEP均耐药。食源性耐药株6株，耐药率为28.57%，其中对1种抗生素耐药5株，以耐AMP为主；对2种抗生素耐药1株，为耐CFZ和AMP。人源性中度敏感株21株，其中对1种抗生素中度敏感19株；对2种抗生素中度敏感2株。食源性中度敏感株9株，其中对1种抗生素中度敏感6株；对2种抗生素中度敏感2株；对3种及以上抗生素中度敏感1株。

2.3 PFGE分型

聚类分析结果显示，56株菌株共有31种带型，带型较为分散，带型间相似性为50.37%～100.00%。7组克隆系中有5组同源性菌株，其中4组人源性菌株，1组食源性菌株，每组同源性菌株携带的毒力基因和耐药谱均一致。7组克隆系内不存在人源和食源性菌株交叉，人源和食源性菌株带型相似性最高为73.33%。克隆系3包含13株菌株，占人源性菌株的37.14%，为本地区主要流行克隆系。见图1。

3、讨论

携带tdh和trh基因的副溶血性弧菌菌株能够产生耐热直接溶血素和耐热直接相关溶血素，tdh基因编码的耐热直接溶血素具有细胞毒性、致死毒性和肠毒性，trh基因编码的耐热直接相关溶血素具有肠毒性。本研究结果显示，tdh基因在人源性菌株中检出率为91.43%，食源性菌株中未检出，与既往研究结果[9,10,11]接近。人源性菌株中检出1株同时携带tdh和trh基因的高毒力菌株，食源性菌株中检出1株携带trh基因，提示奉贤区食品和人群中存在高毒力副溶血性弧菌传播风险，需加强监测。

药敏试验结果显示，人源性菌株耐药率为62.86%，以耐头孢类抗生素CFZ为主；食源性菌株耐药率为28.57%，以耐青霉素类AMP为主，与国内外报道[12,13,14,15]基本一致。人源性中度敏感株21株，且发现1株多重耐药菌株。以上提示奉贤区副溶血性弧菌耐药以头孢类和青霉素类为主，因这2类药物为临床常用药，建议进一步规范感染性腹泻治疗中抗生素的选择。

PFGE广泛应用于追踪病原菌所致传染病的暴发流行，识别散在暴发病例的传染源，被誉为细菌分子分型的“金标准”[16,17]。本研究中56株菌株共有31种带型，带型间相似性为50.37%～100.00%，遗传特性总体上较为分散，但存在主要流行克隆系。人源性菌株和食源性菌株带型相似性最高为73.33%，遗传差异较大，未发现交叉感染。主要流行克隆系3中菌株分离时间为6—10月，时间较长，提示可能存在潜在传染源，应开展流行病学调查，切断可能的传播途径。克隆系2和7菌株分离时间和采样批次相同，提示应加强采样和检测过程操作的规范性，防止污染，确保监测数据的可靠性。

2019年上海市奉贤区分离的56株副溶血性弧菌遗传特性总体上较为分散，但存在主要流行克隆系。食源和人源性菌株间遗传差异较大，存在多重耐药和高毒力菌株，引起食源性疾病的风险较高。需进一步加强副溶血性弧菌感染监测和跟踪，建立长期预警体系，提高食源性疾病防控效果。

参考文献:

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文章来源：赵宏伟,谢晓红,陶力新,沈春莉,沈莉,王洁.奉贤区副溶血性弧菌耐药性和遗传特征[J].预防医学,2021,33(12):1249-1252.