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探讨玉屏风散治疗支气管哮喘的作用机制

2021-03-02 520 上传者：管理员

摘要：目的:运用网络药理学筛选玉屏风散治疗支气管哮喘的作用靶标及信号通路，为临床治疗提供有力依据。方法:利用TCMSP筛选中药活性成分和有效成分靶点信息。利用Uniprot数据库和Excel找出有效成分靶点信息基因名。在GeneCards、OMIM、Drugbank数据库搜集疾病相关靶标，采用Venny软件对中药靶点基因与疾病靶点基因取交集，得到Venny交集图。将各个中药靶点基因共同输入Cytoscape软件，得到中药-靶标调控网络。通过String软件构建中药-疾病共同靶标的蛋白互作网络。将中药-疾病共同靶点基因进行GO和KEGG功能富集分析，采用Cytoscape软件做出共同靶点通路。结果:筛选得到玉屏风散治疗支气管哮喘的主要活性成分17个，中药-疾病共同靶点基因114个，推断其作用机制可能与糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症途径、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等相关，并且可能起到关键作用。结论:基于网络药理学探讨玉屏风散治疗支气管哮喘的作用机制，有利于临床治疗。

关键词：
信号通路
支气管哮喘
核心靶点
玉屏风散
网络药理学
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支气管哮喘简称哮喘，是由多种细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。据统计，全球约有3亿的哮喘患者承受着病痛的折磨[1]。我国哮喘的发病率逐年递增，其中青少年的发病率高达4.2%，由于长期的预防和治疗不佳，已成为世界上哮喘病死率最高的国家[2,3]。目前，本病在病机上尚未完全明确，但可以概括为气道免疫-炎性机制、神经调节机制以及二者相互作用。临床采用激素治疗为主，但效果并不理想，仍然有部分患者不能得到有效的控制，且长期服用激素也会带来一定的毒副作用[4]。玉屏风散对于哮喘疗效较好，该方最早出自《医方类聚》，由黄芪、白术、防风组成，方中以黄芪为君，白术为臣，配伍严谨，临床用于气虚感冒[5]。本研究通过网络药理学对玉屏风散治疗哮喘的作用机制进行了研究，现报告如下。

1、资料和方法

1.1资料

本研究使用的中药、疾病数据库以及平台有:中药系统药理学分析平台(TCMSP)、Uniprot数据库、OMIM数据库、Drugbank数据库、Genecard数据库、Venny软件、Cytoscape软件、Metascape软件、String软件。

1.2方法

1.2.1玉屏风散中的有效成分和靶点预测及靶点基因名的转换

本研究在TCMSP中对玉屏风散的有效成分进行筛选。筛选条件为口服生物利用度(OB)>30%，药物类药性(DL)>0.18[6]，同时应用TCMSP数据库对有效成分靶点进行预测。应用Uniprot数据库对筛选的有效靶点信息进行基因名的转换，由于个别靶点信息在Uniprot中未匹配到基因名，故实际得到的基因名较少。

1.2.2疾病已知靶点基因的获取

以“支气管哮喘”作为查询的关键词，输入到OMIM、Drugbank、Genebank数据库中，对已知疾病靶点基因进行筛选，并删除重复值，最终得到所需疾病基因。

1.2.3中药-靶点网络图和韦恩图的构建

利用Excel软件，将中药靶点基因和疾病靶点基因取交集，得到中药-疾病共同靶点基因，利用Venny软件得到中药-疾病共同靶点基因的韦恩图，将筛选获取得到的中药活性成分及靶点基因Symbol利用Cytoscape软件制作中药-靶点网络图。

1.2.4玉屏风散治疗支气管哮喘的靶点基因蛋白相互作用网络的构建

将中药靶点基因、中药-疾病共同靶点基因、疾病靶点基因利用String软件进行相互作用网络的构建，筛选条件为人类，最小互作分值设定为0.4，得到的节点类型有中药、疾病、中药-疾病共同靶点基因的节点，将结果输入到Cytoscape中进行修饰，得到玉屏风散治疗支气管哮喘的靶点基因蛋白相互作用网络图。

1.2.5GO和KEGG富集分析及通路分析

将中药-疾病共同靶点基因利用Metascape、微生信、Cytoscape软件得到GO和KEGG功能富集分析与靶点通路网络结果。

2、结果

2.1通过TCMSP数据库对玉屏风散的有效成分和靶点信息进行筛选

根据0B>30%、DL>0.18得到主要的17个有效活性成分，以及玉屏风散中药的总靶点信息206个。(见表1)

2.2中药-疾病靶点基因及Venny图构建

对中药靶点基因和疾病靶点基因利用OMIM、Drugbank、Genecard疾病数据库进行筛选，最终得到有效疾病靶点基因共1117个，利用Uniprot数据库及Excel软件进行匹配，获取中药-疾病靶点基因共同Symbol(114个)。玉屏风散中药基因Symbol与总的疾病基因Symbol利用Venny软件进行分析，分析得到114个中药-疾病共同靶点基因。(见图1)

2.3中药-靶点网络图构建

中药白术、防风、黄芪各个有效成分由圆形表示，白术、防风、黄芪是由箭头表示靶点，基因由正八边形表示，图形按照degree值大小进行排列。其中白术有效成分4个，防风有效成分17个，黄芪有效成分17个，中药基因206个。(见图2)

2.4玉屏风散治疗支气管哮喘靶点基因蛋白互作网络

根据研究筛选出玉屏风散治疗支气管哮喘的核心靶点基因、因，白介素-6(IL-6)基因、血管内皮生长因子(VEGFA)、细胞肿瘤抗原p53(TP53)、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白(AKT1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素-8趋化因子(CXCL8)、转录因子AP-1(JUN)。(见图3)

表1TCMSP中玉屏风散治疗疾病有效活性成分筛选

图1中药-疾病靶点基因及Venny构建图

2.5GO功能富集分析

玉屏风散治疗支气管哮喘的核心靶点GO的功能主要有细胞因子介导的信号通路(cytokinemediatedsignalingpathway)、对脂多糖的反应(responsetolipopolysaccharide)、对有毒物质的反应(responsetotoxicsubstance)、对无机物的反应(responsetoinorganicsubstance)、膜筏(membraneraft)。(见图4)

2.6KEGG功能富集分析与通路结果

玉屏风散治疗与气管哮喘的核心靶点基因KEGG的通路富集分析结果如图5所示，其功能主要有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications)、癌症的途径(pathwaysincancer)、IL-17信号通路(IL-17signalingpathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Aktsignalingpathway)。气泡图图形左侧字母为KEGG名称，利用基因的比例作为横坐标，富集的基因数目大小用圆圈大小表示，颜色的鲜亮程度越大表示P值越大，富集的程度越高，相应的P值越小。利用Ctyoscape软件绘制而成的信号-通路靶点网络图，其中箭头节点表示治疗OP的潜在靶点，三角形节点表示信号通路。由图6可知，一条KEGG通路富集到多个靶点基因，多个通路同时围绕一个靶点基因。

图2中药-靶点网络调控构建图

图3玉屏风散治疗支气管哮喘靶点基因蛋白互作网络

图4GO功能富集分析三合一柱状图

图5KEGG功能富集分析气泡图

图6KEGG靶点通路网络调控图

3、讨论

中医学中有关支气管哮喘的记载最早见于《内经》，朱丹溪首创哮喘病名，临床症状包括发作时喉中有哮鸣音，呼吸短促困难，更重者喘息不能平卧等。病机主要是脏腑功能失调，津液凝聚成痰，伏藏于肺，甚者涉及脾肾。肺主宣发肃降，邪气侵袭，肺失宣肃，则气机上逆，发为哮喘;肺为气之主，脾主气机之运化，肾为气之根，病日久，则亦伤及脾肾。玉屏风散对本病有较好的防治作用[7]。李立顺等[8]研究表明，玉屏风散可以延长小鼠咳嗽哮喘的潜伏期。运用玉屏风散加减治疗缓解期支气管哮喘不仅效果显著，还对细胞免疫功能有所改善[9]。

通过网络药理学来探讨玉屏风散治疗支气管哮喘能更深刻地了解其治疗机制。本研究得到的玉屏风散治疗与气管哮喘的核心靶点有IL-6、VEGFA、TP53、AKT1、TNF、CXCL8、JUN。宋桂华等[10]研究表明，通过调控IL-6、IL-10可影响分泌型免疫球蛋白A(SIgA)分泌，增强黏膜免疫而起到治疗哮喘的作用。气道平滑肌(ASM)质量增加是哮喘气道重塑的重要标志，AKT磷酸化在慢性气道疾病中有抗重塑的能力[11]。有研究将30名哮喘患儿和20名健康儿童进行对照，观察其定量逆转录(qRT)聚合酶链反应(PCR)以检查患者血清中miR-221、222和15a的表达水平，结果显示支气管哮喘患儿血清中VEGF-A水平显着升高，表明VEGF-A可能在其发病机制中起到了作用[12]。研究表明，依赖于TP53的自噬将ATR-CHEK1轴激活，与暴露于细颗粒物(PM2.5)的人支气管上皮细胞中促炎性VEGFA产生联系[13]。研究显示，哮喘急性发作和临床缓解的患者具有更高的TNF-α、IL-8和ECP水平，表明TNF-α、IL-8的升高与BA的发展有一定的关系[14]。

本研究得到的较为重要的通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、癌症的途径、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路。在高血糖和钙化情况下，AGE/RAGE信号传导会严重影响细胞和全身反应。研究发现，在AGEs诱导的糖尿病介导的血管钙化中某些抗氧化剂可降低钙沉积的水平，通过探索AGE/RAGE信号级联在糖尿病介导的血管钙化中的作用，可以进行药理干预以降低这种糖尿病并发症的严重程度[15]。有研究表明，甘氨酸可能通过改善乙二醛酶1(Glo1)功能来抑制AGE/RAGE途径及氧化应激，对糖尿病性大血管并发症有预防作用[16]。有研究通过小鼠实验来探讨肺炎症模型中IL-17通路的促炎活性，了解IL-17对人支气管气道平滑肌收缩力的影响，结果显示通过IL-17RA阻断IL-17途径对于哮喘的治疗有一定的作用[17,18]。趋化因子受体CXCR1/2及其配体CXCL8对于激活和运输炎性介质以及肿瘤进展和转移至关重要。CXCL8-CXCR1/2信号轴参与哮喘的发病机制，两者相互作用对于癌症的进展和转移至关重要，CXCR1/2及CXCL8抑制剂治疗哮喘有一定的作用[19]。有研究通过调节PI3K/Akt/mTOR途径评估Brg1对屋尘螨(HDM)诱导的哮喘的抗炎作用，实验组用支气管上皮细胞特异性Brg1敲除小鼠，并使用LY294002抑制PI3K。结果显示，哮喘小鼠中检测到Brg1升高，而PI3K/Akt通路活性降低，当敲除Brg1时，哮喘的严重程度得到缓解，PI3K/Akt/mTOR通路被激活，表明PI3K/Akt途径与气道炎症密切相关[20,21]。

参考文献：

[2]中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南(2016年版)[J].中华结核和呼吸杂志,2016,39(9):675-697.

[4]柳亚慧,时国朝.支气管哮喘的精准治疗[J].中国实用内科杂志,2020,40(5):371-376.

[5]樊茂蓉,张燕萍,苗青.许建中教授治疗缓解期支气管哮喘学术经验[J].时珍国医国药,2010,21(6):1506-1507.

[6]梁学振,许波,李刚,等.基于网络药理学和生物信息学补肾活血胶囊抗骨质疏松的分子机制分析[J].中国骨质疏松杂志,2018,24(6):755-761.

[7]杨苏敏,邓桂平.玉屏风散的临床应用进展[J].西北药学杂志,2008,23(3):192-193.

[8]李立顺,时维静,乐其新,等.玉屏风散镇咳､祛痰及平喘的药效学试验研究[J].中兽医医药杂志,2008,27(4):27-29.

[9]金继超.玉屏风散加减在支气管哮喘患儿缓解期的应用分析[J].北方药学,2018,15(2):70-71.

[10]宋桂华,彭明浩,张岩,等.加味小青龙汤对支气管哮喘慢性持续期患儿的临床疗效及对IL-6､IL-10､SIgA的影响[J].中华中医药学刊,2020,38(9):5-9.

李兴琴,胡泉.基于网络药理学探讨玉屏风散治疗支气管哮喘的作用机制[J].湖南中医杂志,2021,37(02):142-146.